角膜缘niche细胞与基质细胞维持角膜缘干细胞功能的对比研究

目的比较角膜缘niche细胞(limbal niche cells,LNCs)与角膜缘基质细胞(limbal stromal cells,LSCs)在维持角膜缘干细胞功能上的不同特性。方法将LNCs和LSCs分别从6个角膜缘组织分离,并在相同的条件下培养、传代。LNCs与LSCs经丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)处理后分为LNCs组与LSCs组作为饲养细胞分别与角膜缘干细胞共培养,比较两组角膜缘干细胞克隆形成率(colony-forming efficiency,CFE)、上皮细胞复层化以及细胞标志物和部分基因的表达。结果LNCs组角膜缘干细胞CFE(6.57±1.54)%高于LSCs组(1.43±0.47)%。LNCs组细胞复层上皮数(4~5层)多于LSCs组(2~3层)。角膜缘干细胞克隆与免疫荧光染色及mRNA半定量分析结果显示,LNCs组比LSCs组表达了更多干细胞标志物ΔNp63,能更有效地维持角膜缘干细胞的细胞特性。逆转录PCR分析结果显示,LNCs组与LSCs组都分泌了一些维持角膜缘干细胞生长的生长因子,但LNCs组比LSCs组高表达上皮型钙黏蛋白(E-cadherin),低表达营养神经素3(NT3),能更好地支持角膜上皮增殖。结论LNCs比LSCs能更好地支持角膜缘干细胞的生长及维持其干细胞特性。

去除型人皮肤成纤维饲细胞系的建立及其重建角膜表层的研究

目的探讨去除型人皮肤成纤维饲细胞系的建立及其重建角膜表层的相关研究。方法将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、端粒酶逆转录酶(hTERT)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)3种基因导入人皮肤成纤维细胞,建立荧光标记的永生化的可去除型TERT+TK-D人源饲细胞系。将创建的细胞系经丝裂霉素C处理后作为饲养细胞与人角膜缘干细胞共培养,并与3T3饲细胞的培养结果作比较。结果TERT+TK-D细胞系在体外经过6个月的连续传代后仍然表达绿色荧光蛋白,保持旺盛的分裂能力,对更昔洛韦敏感。TERT+TK-D组的克隆形成率(colony forming efficiency,CFE)为(11.77±0.21)%,与3T3组CFE(12.8±1.61)%比较,差异无统计学意义(P=0.332);经过共培养,两组都形成了4~5层复层上皮细胞片。角膜缘干细胞克隆和上皮细胞片的免疫荧光染色及Real-time PCR定量分析结果显示,TERT+TK-D组角蛋白K3表达低于3T3组;PCR结果证实TERT+TK-D饲细胞在更昔洛韦作用下凋亡、裂解,没有混入培养获得的角膜上皮细胞片中。结论转基因荧光标记的永生化的去除型人皮肤成纤维饲细胞有望替代3T3细胞用于角膜再生医疗。