文摘通过克隆人质子感知受体G2A基因、构建G2A基因的表达载体并瞬时转染293T细胞,建立G2A受体调控机理及其功能研究的转基因细胞模型,并检测G2A介导的细胞应答.从人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)中提取总RNA,反转录为cDNA为模板,设计一对针对G2A基因的引物,克隆不含终止密码子的G2A基因并亚克隆到pMD-19T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体pEGFP-N3用HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒pEGFP-N3-G2A,并测序鉴定;重组载体以lipofectamine2000介导转染293T细胞.Real time PCR法检测外源基因在293T细胞中的表达;ELISA检测转染与未转染G2A基因的细胞内三磷酸肌醇(Inositol-1,4,5-triphosphosate,IP3)的含量.测序和酶切证实了克隆到G2A基因并获得pEGFP-N3-G2A表达载体;荧光成像与Real time PCR证实在293T细胞中过表达G2A基因;ELISA检测在酸性刺激下转基因细胞内IP3含量(应答)明显升高,而脂质配体LPC则抑制其IP3的积累,本研究为G2A受体介导信号机制及其功能研究提供一个真核细胞模型.
