稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。

三种血清学方法和qPCR方法在鸡滑液囊支原体检测中的综合应用研究

为评价不同方法对鸡滑液囊支原体(MS)活疫苗免疫和非免疫状态鸡群的监测效果,研究分别采用HI、SPA与ELISA三种抗体检测方法和qPCR方法同步对某养殖场A、B和C三组鸡群进行MS感染和抗体水平监测,其中A鸡群23日龄免疫MS活疫苗(MS-H株),B、C鸡群不免疫MS疫苗。结果显示:三种血清学检测方法所测MS抗体阳性率趋势基本一致,HI抗体效价变化规律和ELISA抗体效价变化规律相似,但血清学方法相对于qPCR方法具有一定的滞后性,qPCR可以最早发现MS野毒感染,且在使用活疫苗免疫的情况下对疫苗和野毒进行鉴别检测。研究提示:在条件允许的情况下,qPCR可以作为MS首选的监测方法;当检测条件受限时,上述三种血清学方法同样也可以用于评估MS野毒感染状况,但对结果的判断受母源抗体水平、疫苗免疫状况、野毒感染时间等多重因素的影响,在结果判断时应进行综合分析。

单细胞转录组学技术及其在寄生虫研究中的应用进展

单细胞转录组代表了某一时刻单个细胞内所有mRNA总表达量,其表达量反映该细胞的总体特征。通过单细胞转录组测序(single cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术对单个细胞的全部RNA进行逆转录、扩增和测序,测序结果中包含的大量信息有可能重塑对发育生物学、基因调控以及健康和疾病中细胞异质性的理解。随着科学技术的不断发展,测序技术也在不断进步,scRNA-seq全方位、高通量以及高分辨率的特点可构建更细致、全面和精准的单细胞图谱。本文综述了常用scRNA-seq方法及其数据分析主要流程和单细胞转录组学技术在寄生虫学与寄生虫病领域研究中的应用,以期为该领域相关研究提供参考资料。

QX型传染性支气管炎病毒病毒样颗粒的制备与初步评价

研究旨在制备一种针对QX型传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗并对其免疫保护效果进行初步评价。试验首先构建了分别表达QX型IBV S蛋白(QXLS)、M蛋白(QXLM)和E蛋白(QXLE)的三种重组杆状病毒rBacmid-QXLS、rBacmid-QXLM和rBacmid-QXLE,并通过间接免疫荧光试验(IFA)和West-ern blot鉴定目的蛋白的表达;进一步将3种重组杆状病毒通过适当比例共感染Sf9细胞获得VLP,经蔗糖密度梯度离心纯化后使用透射电子显微镜观察鉴定VLP的组装效果;最后将纯化的VLP与氢氧化铝佐剂混合制成疫苗免疫SPF鸡进行免疫保护效果评价。结果显示:S、M和E三种目的蛋白均能成功表达,透射电子显微镜观察可见组装形成的VLP呈现典型的椭圆形病毒样结构,直径为80~120 nm;单独VLP疫苗免疫具有一定的免疫保护效果,QXL87+VLP疫苗联合免疫保护效果较好,可有效减轻临床病变、降低气管和泄殖腔排毒量及组织器官载毒量。研究表明,试验已经成功制备出QX型IBV VLP,且具有良好的免疫原性,为后续进一步研制基于VLP技术的QX型IBV基因工程疫苗奠定了基础。

无线网络智能化的探索和应用

随着5G网络的完善和5G流量的快速增长,如何满足网络连接的多样化需求,提升客户感知保障能力,成为网络运营智能化的关键点。介绍了某省联通在无线网络智能化、潜在贬损用户识别与感知提升方面所做的探索与实践,通过整合XDR话单和专业网管等多源数据,引入熵权法、分层二元评分法等科学算法模型,结合用户体验回访结果不断迭代优化算法,实现了对潜在贬损用户的有效识别,同时在感知驱动网络问题闭环解决方面也取得了较好的效果。

检测鸡毒支原体抗体的间接ELISA方法和HI试验方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)抗体的间接ELISA方法,结合HI试验,为MG感染的监测和净化提供一套有效的组合技术方案。以原核表达的VlhA 3.03重组蛋白(rVlhA)作为包被抗原,使用单一稀释法构建了关于血清抗体滴度与1∶500血清稀释度处S/P值的回归方程lg(抗体滴度)=1.257×lg(1∶500处S/P值)+3.709,R^(2)=0.9176,S/P临界值为0.32,临界滴度是1200。经验证,rVlhA-ELISA方法具有良好的特异性、重复性,最低能检出1∶2000稀释的阳性血清。选择国内MG分离株SH/2020-1作为血凝抑制抗原建立HI试验方法。使用rVlhA-ELISA方法联合HI试验进行血清样品检测,IDEXX-MG方法作为对照,借助RT-qPCR方法监测MG感染情况。结果表明rVlhA-ELISA方法和IDEXX-MG监测的血清抗体趋势与HI复核结果均一致;rVlhA-ELISA与HI联合判定结果与IDEXX-MG符合率可达91.53%。上述结果显示,本研究建立的rVlhA-ELISA方法和HI试验具有较好的临床应用价值,可以初步应用于MG感染的临床大规模、快速筛查并对结果进行复核。

母源抗体对禽滑液囊支原体减毒活疫苗免疫效果的影响评估

本研究以具有高水平禽滑液囊支原体(MS)特异性母源抗体商品蛋鸡作为实验动物,评估了母源抗体对MS减毒活疫苗免疫效果的影响。分别在7日龄、14日龄、21日龄和28日龄免疫MS-H株活疫苗,每周采集腭裂拭子样品,通过荧光定量PCR方法(qPCR)检测MS-H疫苗株基因组拷贝数,以评估疫苗株在体内的定植情况。在28日龄免疫组免疫后5周对各试验组用MS强毒株进行攻毒,连续观察4 w,每周采集腭裂拭子通过qPCR方法检测攻毒菌株基因组拷贝数,以评价疫苗免疫对野毒感染的阻断效果,最后扑杀并剖检所有试验鸡,观察和记录特征性病变。结果表明,MS特异性母源抗体在3周龄时基本降至阴性水平,早期高母源抗体水平对疫苗毒株的定植会产生一定程度的影响,但不同时间免疫组疫苗株均能有效定植,且对强毒株攻毒的保护效果影响不显著。本研究的相关结果对于指导生产中科学制定MS活疫苗的免疫程序具有重要的参考意义。

西藏牦牛、绵羊棘球蚴病病原的分子鉴定

本研究旨在对西藏自治区那曲地区和拉萨市牦牛、绵羊体内棘球蚴病原进行分子生物学鉴定并分析其遗传变异规律。对2016年11月底采自西藏拉萨市当雄县和那曲地区嘉黎县的5只绵羊体内的5个棘球蚴包囊、15头牦牛体内的18个棘球蚴包囊分别分离棘球蚴原头蚴或生发层组织,提取基因组DNA,应用PCR方法扩增nad 1基因,通过测序获得nad1全基因序列。运用DNAStar MegAlign软件对序列进行同源性分析。以GenBank中已公布的棘球属的nad1全基因序列为比对对象,采用最大似然法(ML)构建系统发育树。结果显示,所测定的牦牛和绵羊的23个棘球蚴病原nad 1基因序列与GenBank登录的细粒棘球蚴狭义种(G1基因型)nad 1基因序列高度同源,同源性为99.6%~99.8%,23条nad 1基因的遗传距离为0~0.0022447。同源基因的碱基变异率为0.2%~0.4%;与棘球属其他棘球绦虫同源基因的碱基变异率为14.9%~19.8%。有5个样本的nad 1基因在不同位点发生碱基突变,变异位点发生序列转换。以上结果表明,本研究所采集牦牛和绵羊的棘球蚴为细粒棘球绦虫G1基因型,其nad 1基因变异小,序列一致性高。

Ⅰ群禽腺病毒FAdV-4 SN2016株的分离与鉴定

本研究对疑似禽腺病毒感染的鸡病料进行了病毒分离、PCR扩增基因与序列分析以及动物回归试验。结果显示:分离的病毒为球形、无囊膜,直径在70~80 nm,不具有凝集红细胞能力;毒株基因组全长43 634 bp,与Ⅰ群禽腺病毒同源性介于95.8%~99.7%,与Ⅱ群和Ⅲ群禽腺病毒同源性为34.4%~37.3%;毒株对3周龄SPF鸡的致死率为100%,死亡鸡可见典型的心包积液与包涵体肝炎症状,肝细胞染色可见嗜碱性包涵体。结果表明,本研究成功分离到1株Ⅰ群禽腺病毒C基因型血清4型病毒,命名为FAdV-4 SN2016,为下一步疫苗研制提供了坚实的物质基础。

传染性支气管炎病毒N蛋白广谱单克隆抗体的制备与鉴定

为制备能与多种基因型传染性支气管炎病毒(IBV)反应的广谱性单克隆抗体,反应谱能够覆盖当前在国内流行的主要优势基因型毒株。通过RT-PCR克隆了QX型IBV CK/CH/JS/2010/12株N基因,分别插入原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6P-1构建了重组质粒pET-N和pGEX-N,并在大肠杆菌中进行原核表达,通过亲和纯化获得His-N和GST-N两种重组融合蛋白。用GST-N融合蛋白免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以重组蛋白His-N作为检测抗原建立间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。经过筛选和亚克隆,共获得12株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western blot结果显示8株单克隆抗体能与测试的所有基因型IBV发生特异性反应,另外4株可以与793B型4/91株以外的其他毒株发生反应。本研究成功获得了广谱性IBV单克隆抗体,为进一步研究建立通用性IBV抗原检测方法奠定了基础。

新疆北疆部分地区牛羊包虫病流行病学调查与cox1和nad1基因分析

为掌握北疆部分地区牛羊包虫病流行情况及虫种(基因型)分布特点,2019年4月至2019年9月在北疆阿勒泰、昌吉和伊犁部分屠宰场对牛(n=210头)和绵羊(n=2294头)进行调查。确诊宿主共有40例,平均感染率为1.60%,其中昌吉的感染率(3.85%)最高。将5头牛和51只绵羊肝肺上采集的78个疑似包囊样本进行PCR扩增,结果显示,源自37个宿主共57个疑似包囊样本检测cox1基因呈阳性;源自39个宿主共59个疑似包囊样本检测nad1基因呈阳性。PCR产物测序和单倍型分析结果表明,所有分离株均为细粒棘球蚴G1基因型,包括25个单倍型(cox1)和8个单倍型(nad1)。本研究揭示单个宿主可以感染多个单倍型,表明一个宿主可能感染不同的虫株。该试验结果为北疆包虫病分子流行病学研究提供参考数据。

猪流行性腹泻病毒3种结构蛋白的原核表达与免疫原性分析

根据大肠埃希菌密码子使用的偏嗜性,对G2b亚型猪流行性腹泻病毒(PEDV)JSX2014株S基因(94~525、1 306~1 641nt 2个区域)、M基因(544~669nt)和N基因(397~960nt)进行优化和基因合成,分别克隆入pET-32a(+)中,获得4种重组原核表达载体pET-Opti-S-D1、pET-Opti-S-D2、pET-Opti-M和pET-Opti-N。将重组表达载体转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定,4种重组蛋白均可获得正确表达。以表达蛋白为抗原制备的兔多抗血清,通过间接免疫荧光试验鉴定,均能与JSX2014株感染的Vero细胞发生特异性反应。进一步通过中和试验鉴定,S-D1蛋白特异性多抗血清可有效阻断JSX2014株对Vero细胞的感染。这一结果提示所表达的目的蛋白均具有良好的免疫原性,可以进一步用于G2b亚型PEDV抗体检测方法的建立。

基于微滴数字PCR技术的婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌定量检测及应用

应用微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)技术,建立婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌定量检测方法。以双歧杆菌的单拷贝特异性基因rpsL为目标基因设计引物探针,对ddPCR条件进行优化,考察方法的特异性、灵敏度和重复性,并与平板计数方法进行对照验证。结果表明,建立的方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。细菌纯培养液的检出限为296 CFU/mL,模拟样品检出限为7 300 CFU/g,不与10种近缘乳酸菌发生交叉反应,且重复性较好,采用已建立的ddPCR方法和平板计数方法对市售婴幼儿配方乳粉样品进行检测,2种方法测定值结果偏差小于10%,结果一致性较好。本研究建立的ddPCR方法对婴幼儿配方乳粉中的双歧杆菌定量检测能够更快速、灵敏、准确,具有一定的应用前景。

超早期微创置管术联合尿激酶对高血压脑出血患者血肿清除效果、炎症反应及脑血流动力学的影响

目的探讨超早期微创置管术联合尿激酶对高血压脑出血(HICH)患者血肿清除效果、炎症反应及脑血流动力学的影响。方法选择2020年1月至2021年2月我院收治的60例HICH患者作为研究对象,根据治疗方案将其分为对照组(30例,超早期微创置管术)和观察组(30例,超早期微创置管术+尿激酶)。比较两组患者的血肿清除效果、炎症指标[基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]、脑血流动力学指标[双侧大脑中动脉(MCA)、大脑前动脉(ACA)、大脑后动脉(PCA)、左右椎动脉(VA)的血流速度]及神经功能指标[神经元特异性烯醇化酶(NSE)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)]。结果术后5 h,两组的血肿残存率比较,差异无统计学意义(P>0.05);术后7、15、30 d,两组的血肿残存率均降低,且观察组明显低于对照组(P<0.05)。治疗后,两组的MMP-9、CRP、TNF-α水平均降低,且观察组明显低于对照组(P<0.05)。治疗后,两组的MCA、ACA、PCA、VA血流速度均升高,且观察组明显高于对照组(P<0.05)。治疗后,两组的NSE水平均降低,BDNF、NGF水平均升高,且观察组明显优于对照组(P<0.05)。结论超早期微创置管术联合尿激酶用于HICH患者临床治疗中,不仅可提高血肿清除效果,还能改善机体炎症反应指标及脑血流动力学指标,减轻神经功能损伤,值得临床推广应用。

某院1065例尿路感染病原菌分布及耐药性分析

目的了解该院尿路感染病原菌的分布与耐药情况,为临床治疗提供参考。方法收集该院2018年1月至2019年12月所有尿培养阳性菌株,对1065株病原菌进行菌种鉴定和药敏试验。结果共有11253份中段尿培养标本送检,在剔除相同患者的重复菌株后分离出有效菌株1065株。以革兰阴性菌(777株)为主,占73.0%;革兰阳性菌(226株)占21.2%;真菌(62株)占5.8%。排名前5位的病原菌分别是大肠埃希菌(45.7%)、粪肠球菌(8.7%)、肺炎克雷伯菌(8.6%)、屎肠球菌(6.0%)、白色念珠菌(3.6%)。肠杆菌科细菌中,产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的大肠埃希菌225株(47.6%)、产ESBLs的肺炎克雷伯菌30株(32.6%)。主要革兰阳性菌中,未检出对万古霉素、替考拉宁耐药的肠球菌。结论不同地区尿路感染病原菌和耐药特点也不同,应及时总结、分析当地病原菌分布特点及耐药性,为临床合理应用抗菌药物提供参考依据。

Investigation on Infection of PCV2 in Taizhou Areas of Jiangsu Province

In order to investigate infection and harm extent of swine porcine circovims 2 （PCV2） in pigs in Taizhou of Jiangsu, and to control the prevalence of PCV2 in Taizhou areas. A total of 116 PCV2 clinical samples came from six different cities （districts） from 2011 to 2012 were tested in etiologic by the method of PCR. The test restdts showed that the total positive rate of PCV2 clinical samples was 53.45%, and PCV2 existed in all the six places. The positive rate of the scale pig farms was 48.33%, the positive rate of free-range farmers was 58.93%. Thus, PCV2 was prevalent in pigs in Taizhou areas, and which should be paid more attention to.

基于图形处理器的形态学重建系统

形态学重建是医学图像处理中非常基础和重要的操作。它根据掩膜图像的特征对标记图像反复进行膨胀操作,直到标记图像中的像素值不再变化为止。对于传统基于中央处理器(CPU)的形态学重建系统计算效率不高的问题,提出了使用图形处理器(GPU)来加速形态学重建。首先,设计了适合GPU处理的数据结构:并行堆集群;然后,基于并行堆集群,设计和实现了一套基于GPU的形态学重建系统。实验结果表明,相比传统基于CPU的形态学重建系统,基于GPU的形态学重建系统可以获取超过20倍的加速比。基于GPU的形态学重建系统展示了如何把基于复杂数据结构的软件系统高效地移植到GPU上。

典型草原绵羊牧食行为对放牧强度的响应

草地家畜的牧食行为受放牧草地供给资源量的影响,而放牧强度通过调控植物群落结构间接影响草地的植物资源供给。然而,放牧强度、牧食行为以及植物群落结构之间的相互关系和影响路径并没有得到很好的验证。本研究基于内蒙古锡林郭勒典型草原区放牧(轻度放牧、中度放牧和重度放牧)控制实验,采用人工全天追踪观察,并结合缩时拍和GPS定位,监测不同放牧强度下绵羊个体采食、反刍、站立、卧息以及游走等行为特征,探究绵羊牧食行为对不同放牧强度的响应模式。结果表明:(1)随放牧强度增加,群落总生物量降低,绵羊厌食的大针茅生物量增加,喜食的羊草和冰草等根茎型禾草以及知母等杂类草在减少。(2)随放牧强度增大,绵羊卧息和站立等保养时间显著减少,重度放牧延长了绵羊采食时间,而中度放牧降低了反刍速率;随季节推移,反刍时间减少,游走里程和采食时间大体上都经历了先减少后增加的过程。重度放牧导致草原群落物种组成的变化,地上生物量减少,优良牧草比例减少,于是绵羊会通过增加采食时间,降低卧息和站立等保养时间来确保其生存所需食物的获取。因此,在退化草地的家畜牧食行为研究中要重视群落结构的重要性,厘清这些关系有利于实施精准化的放牧管理和退化草地的快速恢复。

鸡传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

建立了一种检测鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)抗体终点滴度(end-point titer,ET)的间接ELISA方法,以应用于监测鸡免疫疫苗或者感染野毒后的抗体。以大肠杆菌表达的IBV核衣壳(N)蛋白作为包被抗原,以SPF鸡血清和感染IBV的SPF鸡血清分别作为阴性血清和阳性血清对照,优化确定出ELISA的各项技术参数。对66份SPF鸡血清进行测试,确定了阴、阳性S/P临界值为0.385。特异性试验表明包被抗原与其他常见病原的阳性血清均不发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10.00%。选取了50份临床血清样品,通过阳性-阴性阈值(positive negative threshold,PNT)基线确定ET值,建立了固定血清稀释倍数(1∶500)处S/P值与ET的线性回归方程,相关系数(R2)为0.9593(P<0.0001)。通过检测2个商品鸡群在1~49日龄不同时间点采集的461份血清样本,比较了建立的IBVN-ELISA方法与IDEXX公司提供的商品化试剂盒。本研究建立的IBVN-ELISA方法与该商品化试剂盒相比总体符合率为93.06%,抗体滴度的消涨趋势基本一致,ELISA的敏感性和特异性分别达到99.75%和100.00%(P<0.0001)。结果表明,本研究建立的ELISA方法是一种良好的检测方法。

快速荧光PCR法检测包装饮用水中产气荚膜梭菌

由产气荚膜梭菌引起的包装饮用水污染在世界范围内的报道越来越多。产气荚膜梭菌既是水微生物污染的一种指示菌,同时也是一种致病菌,对人类生命和健康构成潜在威胁。该研究开发了一种基于实时荧光PCR的快速检测包装饮用水中的产气荚膜梭菌新方法。该方法针对cpa基因设计引物和探针,用于检测产气荚膜梭菌。50 mL水样膜过滤后在(36±1)℃下孵育4 h,提取菌体DNA,采用实时荧光PCR检测。结果显示该方法特异性强,检出限为1 cfu/50 mL。PCR反应混合物预混冻干和核酸提取优化使整个检测过程用时≤6 h,实时荧光PCR检测结果与国家标准方法GB 8538—2016检测结果一致。因此,该实时荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短等特性,为日常包装饮用水中产气荚膜梭菌监管和质控提供了新的检测技术手段。