H9亚型禽流感病毒M1蛋白原核表达及免疫效果初步研究

旨在原核表达H9亚型禽流感病毒(AIV)M1蛋白,初步探究其免疫效果,为研制AIV疫苗奠定基础。通过构建重组质粒pET-32a-M1,诱导表达,Western blot验证蛋白表达情况,将重组蛋白免疫接种小鼠,通过测定血清中IgG抗体效价,脾细胞培养上清多细胞因子分泌情况评价其免疫效果。结果显示,M1重组蛋白主要以可溶性蛋白存在,Western blot结果可见特异性条带。免疫接种小鼠后,血清产生IgG抗体,抗体效价为1∶30000。小鼠脾细胞上清液IL-2、IL-4、IL-6与对照组相比较,含量显著增加(P<0.01),而抑制IL-1β、IL-5、IL-13、IL-12p70、IL-18、GM-CMF、IFN-γ、TNF-α分泌。结果表明,M1重组蛋白免疫原性良好,刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,为禽流感疫苗深入研究奠定了基础。

H1亚型禽流感病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的建立及应用

以H1亚型AIV的HA基因为研究对象,采用重组聚合酶核酸等温扩增技术(RPA),通过RT-PCR方法优选出1套引物,进而优化体系的反应温度、最佳探针及引物浓度,使用优化后的最佳反应体系进行敏感性及特异性试验,并探索该方法能达到的最短反应时间,利用侧向流动免疫(LFD)试纸条观测反应后的结果,最终建立检测H1亚型AIV的RT-RPA-LFD快速检测方法。结果表明:建立的RT-RPA-LFD快速检测方法在探针工作浓度为0.14 mmol/L,37℃条件下反应20 min,可最低检测到1.5×10^(2)copies/反应的H1亚型AIV RNA,其他常见家禽病原体未见阳性反应。该方法与RT-PCR及鸡胚分离鉴定测序结果完全一致,可满足H1亚型AIV临床快速鉴别诊断的需求,为基层兽医现场快速检测提供技术支撑。

血清4型禽腺病毒penton蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备和鉴定血清4型禽腺病毒(FAdV-4)五邻体(penton)蛋白单克隆抗体,为深入探究penton蛋白在FAdV-4感染致病机制中的作用及为抗原检测试剂研发提供抗体材料。【方法】以原核表达的FAdV-4 penton重组蛋白免疫6~8周雌性BALB/c小白鼠,加强免疫3次后,取鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,通过penton-酶联免疫吸附剂测定(ELISA)和FAdV4 virus-ELISA方法分别筛选阳性杂交瘤细胞株,对筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚类鉴定、特异性和广谱性鉴定及间接免疫荧光和稳定性试验。【结果】亚类鉴定结果表明,筛选获得7株能稳定分泌抗FAdV-4 penton蛋白的杂交瘤细胞株(1D11、2B3、2C4、2C9、6B3、8F12和8G11),其轻链均为Kappa链,重链3株为IgG1,4株为IgG2b;特异性检测结果表明,7株单克隆抗体只与FAdV-4反应,不与其他11种血清型FAdV及NDV、ARV、EDSV和IBV等常见禽病病原体发生交叉反应;广谱性鉴定结果表明,7株单克隆抗体均可与19株FAdV-4分离株结合,广谱性好;间接免疫荧光试验结果表明,7株单克隆抗体均与感染FAdV-4的鸡胚肝细胞(CEL)结合,出现明亮的绿色荧光。对筛选出的3株单克隆抗体(6B3、8F12和8G11)进行稳定性检测,发现其稳定性良好。【结论】通过单克隆抗体制备和鉴定获得3株与FAdV-4蛋白结合效果较好并具有特异性和广谱性的FAdV-4 penton蛋白杂交瘤细胞株(6B3、8F12和8G11),能稳定分泌penton蛋白单克隆抗体,为深入研究penton蛋白在FAdV-4感染致病机制中的作用提供单抗,为FAdV-4抗原检测试剂的研发打下基础。

护士道德困境干预的最佳证据总结

目的检索、评价并整合国内外护士道德困境干预的最佳证据,为临床护理工作者提供参考。方法计算机检索BMJ Best Practice、UpToDate、澳大利亚JBI循证卫生保健中心数据库、国际指南网、美国指南网、加拿大安大略注册护士协会、英国国家健康与临床优化研究所、苏格兰学院指南网、Cochrane Library、Web of Science、PubMed、Embase、OVID、CINAHL、中国生物医学文献数据库、万方数据库、中国知网、中国医脉通指南网、维普数据库中关于护士道德困境干预的相关证据,包括证据总结、指南、系统评价、专家共识、临床决策。检索时限为建库至2022年7月31日。结果本研究最终纳入13篇文献,包括2篇指南、3篇证据总结、8篇系统评价。最终从有效沟通、自我调节、资源支持、培训教育、伦理氛围5个方面汇总了17条最佳证据。结论该研究总结了护士道德困境干预的最佳证据,在临床应用时,需考虑实际情况,与护士自身结合,审慎的选择相应的证据,促进护士的身心健康,提高护理质量。

X蛋白(pX)在血清4型禽腺病毒感染LMH细胞后对Toll样受体的影响

【目的】研究X蛋白(Protein X,pX)在血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)感染LMH细胞后对Toll样受体产生的影响,为进一步阐释FAdV-4感染致病机制和免疫应答机理提供数据参考。【方法】通过PCR扩增X基因编码区序列,与pEF1α-HA载体连接,构建重组表达质粒pEF1α-HA-X。将重组表达质粒pEF1α-HA-X和空质粒pEF1α-HA分别转染LMH细胞,24 h后用FAdV-4感染转染后的细胞,2个处理组分别标记为pEF1α-HA-X+和pEF1α-HA+;同时设立转染后未加病毒刺激组作对照,分别标记为pEF1α-HA-X-和pEF1α-HA-。用Western-blotting和间接免疫荧光验证重组蛋白表达情况,实时荧光定量PCR检测Toll样受体(chTLR1a、chTLR1b、chTLR2a、chTLR2b、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15、chTLR21)和效应因子(IFN-α、IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-15)mRNA转录水平的变化。【结果】X基因开放阅读框(ORF)全长540 bp,共编码179个氨基酸残基。Western-blotting结果显示重组X蛋白与HA标签小鼠源单克隆抗体反应,在27 kD处得到单一条带,间接免疫荧光结果可见绿色荧光。实时荧光定量PCR检测发现,与pEF1α-HA-组相比较,pEF1α-HA-X-组chTLR1a和chTLR1b的mRNA转录水平极显著上调(P<0.01,下同),分别为pEF1α-HA-组的9.76和12.34倍;chTLR2a、chTLR2b、chTLR5、chTLR7、chTLR15和chTLR21的mRNA转录水平显著上调(P<0.05,下同)。添加病毒感染后,与pEF1α-HA-X-组相比,pEF1α-HA-X+组chTLR1a和chTLR1b的mRNA转录水平极显著下调,分别下调60.0%和66.7%;chTLR2a、chTLR2b和chTLR3的mRNA转录水平显著提高,分别显著上调2.91、2.01和1.47倍,其他chTLRs的mRNA转录水平下调,但差异不显著(P>0.05);同时,pEF1α-HA-X+组效应因子IFN-α、IFN-β、IL-1β的mRNA转录水平比pEF1α-HA-X-组显著上调,IL-8的mRNA转录水平极显著下调。【结论】在LMH细胞过表达pX并被FAdV-4感染后,pX能激活宿主免疫应答系统,Toll样受体(chTLR2a、chTLR2b和chTLR3)和其效应因子(IFN-α、IFN-β和IL-1β)的mRNA转录水平显著上调以抑制病毒复制,说明pX具备激活宿主细胞天然免疫系统的功能。

血清4型禽腺病毒Ⅷ蛋白真核表达及其对LMH细胞天然免疫相关基因的影响

【目的】分析血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Ⅷ蛋白(ProteinⅧ,pⅧ)对宿主天然免疫相关基因表达的影响,为进一步研究FAdV-4的致病机理提供参考依据。【方法】通过PCR扩增FAdV-4Ⅷ基因编码区序列,与pEF1α-HA载体连接,构建重组表达质粒pEF1α-HA-Ⅷ。用pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒(试验组)和pEF1α-HA空质粒(对照组)转染LMH细胞,利用Western blotting和间接免疫荧光验证Ⅷ蛋白表达情况,实时荧光定量PCR测定STING、MDA5、TBK1、MAVS、NF-κB、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β基因的表达水平。【结果】Ⅷ基因开放阅读框(ORF)全长744 bp,共编码247个氨基酸残基,真核表达获得的Ⅷ重组蛋白与鼠源HA标签单克隆抗体产生特异性反应,在34 kD处得到单一条带;间接免疫荧光检测可见绿色荧光,说明Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中得到良好表达。与对照组相比,Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中表达后,模式受体STING基因的表达水平显著提高5.6倍(P<0.05,下同),MDA5基因的表达水平提高30%;接头蛋白TBK1和MAVS基因表达水平分别较对照组显著提高1.5和2.4倍;转录因子IRF7的表达水平显著提高3.4倍,而NF-κB基因被抑制表达。同时,干扰素(IFN-α和IFN-β)和白介素(IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β)的表达水平均上调,IFN-α和IFN-β分别极显著上调19.2和14.4倍(P<0.01),而IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β分别显著上调4.1、2.1、6.0和7.9倍。【结论】在LMH细胞中过表达FAdV-4 pⅧ,STING、MDA5、TBK1、MAVS、IRF7、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β等天然免疫相关基因呈上调表达,表明Ⅷ蛋白对FAdV-4激发宿主的天然免疫具有一定促进作用。

鸡细小病毒NS1和VP2蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】原核表达鸡细小病毒(ChPV)的NS1和VP2蛋白,制备其多克隆抗体,为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列,构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2,将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达,优化表达条件,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体(SPF)鸡获得多克隆抗体,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价,以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析显示,NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104和87 kD,与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选,结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)终浓度1.0 mmol/mL,16℃诱导表达过夜;VP2蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/mL,20℃诱导表达过夜。可溶性分析显示,NS1和VP2蛋白主要以包涵体形式存在;间接ELISA检测NS1和VP2蛋白的多克隆抗体效价均为1∶10 240 000;Western-blotting鉴定表明,His标签蛋白和相对应的鸡多克隆抗体均能与NS1和VP2蛋白特异性结合;IFA分析显示,VP2和NS1蛋白多克隆抗体均能与ChPV特异性结合。【结论】本研究成功表达ChPV的NS1和VP2蛋白和制备的鸡多克隆抗体,可作为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立ChPV血清学诊断方法的基础材料。

微滴式数字PCR定量检测禽偏肺病毒方法的建立

为建立禽偏肺病毒(aMPV)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本研究以aMPV F基因为靶基因,根据其保守区域设计特异性引物和探针,通过各反应条件的优化,初步建立检测aMPV的dd PCR方法。反应条件优化结果显示,最佳引物终浓度1μmol/μL,探针终浓度0.5μmol/μL,退火温度56℃。绘制的标准曲线显示,重组质粒标准品稀释倍数的对数与相应质粒检出拷贝数的对数呈良好的线性关系(R^(2)=0.9998)。采用该方法同时检测aMPV、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒,结果显示,仅aMPV检测为阳性,其他病原均为阴性。特异性较强。将p MD18-aMPV重组质粒标准品10倍倍比稀释(10^(5)~10^(9),4.3×10^(3)拷贝/μL~4.3×10^(-1)拷贝/μL)后作为模板,采用该方法检测,结果显示该方法对重组质粒标准品的检测限为4.3拷贝/μL,比荧光定量PCR(qPCR)检测限(43拷贝/μL)敏感。对3个稀释度质粒标准品的批内和批间重复性试验结果显示,批内和批间试验的变异系数均小于5%。对采集的82份病鸡气管和脾组织样品同时采用dd PCR和荧光定量PCR检测,结果显示,两种方法对aMPV的阳性检出率均为4.88%(4/82),阴性样品均为78份,二者的符合率达100%,dd PCR检出的4份阳性样品中aMPV的拷贝数为78拷贝/μL~920拷贝/μL。上述结果表明,本研究建立的dd PCR方法特异性强、敏感性高和重复性好,为aMPV检测提供新的技术手段,对其早期感染的防控有重要意义。

血清4型禽腺病毒广西分离株单克隆抗体的制备及鉴定

为制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)广西分离株(FAdV-4-GX2018-005)的特异性单克隆抗体,将FAdV-4-GX2018-005作为免疫原免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株。利用阳性杂交瘤细胞株制备腹水并纯化得到单克隆抗体,利用ELISA和IFA鉴定单克隆抗体的特异性。结果表明,成功获得3株单克隆细胞株3A3、13A11和4D5。3株杂交瘤细胞株分泌的抗体,能与FAdV-4产生特异性反应,与其他血清型禽腺病毒(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10和FAdV-11)不发生反应。本研究成功制备FAdV-4广西分离株单克隆抗体,为FAdV-4检测方法的建立奠定了良好基础。

鸡细小病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种可定量检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)新型检测方法。引物设计参考了GenBank中ChPV的NS基因保守序列,筛选了特异性探针引物组,采用不同探针引物浓度组合和退火温度梯度对反应条件进行优化,并通过使用该方法与荧光定量PCR(qPCR)和普通PCR方法进行灵敏度比较,同时对其他常见禽病病原体进行检测,以及对40份临床样品进行检测,评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法最佳引物浓度均为900 nmol/L,最佳探针浓度为600 nmol/L;最佳退火温度为54.0℃;灵敏度比qPCR和普通PCR分别高10倍和1000倍,最低检测限为4.5 copies/μL;对其他常见禽病病原体进行ChPV微滴式数字PCR检测,结果均为阴性;批内和批间重复性较好,变异系数小。结果表明,所建立的ddPCR方法具有更高的敏感性和准确性,可成功用于快速定量检测ChPV感染。

鹧鸪源基因Ⅻ型新城疫病毒对SPF鸡致病性的研究

为研究鹧鸪源基因Ⅻ型新城疫病毒(NDV)FP158对SPF鸡的致病性,测定了FP158的鸡胚平均死亡时间(MDT)和脑内接种致病指数(ICPI),将FP158感染6周龄SPF鸡后,观察其临床症状,测定喉头和泄殖腔棉拭子中病毒的鸡胚半数感染量(EID_(50));感染后第3天随机处死3只鸡,观察其剖检病变,并采集内脏器官制备病理切片观察病理变化。结果显示,FP158的MDT为57 h,ICPI为1.65。SPF鸡在感染后第3天开始出现精神萎靡,排黄绿色稀便,轻微的呼吸道症状和轻微的神经症状,到第9天后症状逐渐消失。感染后SPF鸡喉头和泄殖腔排毒逐渐升高,至第3天达到高峰,后逐渐降低,至第13天检测不到排毒。剖检发现盲肠扁桃体出血,其他组织器官未发现明显病变。病理切片观察发现大脑局部神经元变性,嗜酸性增强;肺脏支气管黏膜水肿,大量炎细胞浸润,部分上皮细胞脱落,管腔充满炎性渗出物;盲肠扁桃体异嗜性细胞浸润。对照组SPF鸡临床表现正常,排毒检测为阴性,无剖检病变和组织病理学变化。研究结果表明,鹧鸪源基因Ⅻ型NDV能感染SPF鸡。

二重荧光RT-LAMP方法鉴别检测口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒

口蹄疫和水泡性口炎是牛常见高度急性病毒传染病,在全球范围内广泛存在。本研究旨在建立一种可同时鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据口蹄疫病毒(FMDV)3D基因和水泡性口炎病毒(VSV)N基因的保守序列,设计了2套特异性引物,在每条内引物的5′端标记荧光基团,通过扩增产物颜色判断检测结果。优化反应条件,建立了可同时检测口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT-LAMP方法。结果显示,该方法灵敏性高,每个反应最低能够检测到100个拷贝混合模板;特异性好,能在同一个反应管里检测到两种病毒,对其他牛病原体无扩增;干扰性小,扩增效率不受模板浓度影响。本研究建立的口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重荧光RT-LAMP方法具有简便、快速、特异、敏感等优点,可用于FMDV和VSV的临床检测和流行病学调查。

鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒三重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立能同时检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)和禽流感病毒(AIV)的三重PCR检测方法,为临床上快速诊断及有效防控NDV、ChPV和AIV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考NCBI中已公布NDV的F基因(登录号DQ195265.1)、ChPV的NS1基因(登录号GU214704.1)和AIV的M基因保守区(登录号DQ485211.1),设计合成针对NDV、ChPV和AIV的特异性引物,应用这3对引物建立三重PCR检测方法,对反应体系及扩增程序进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测等评估其实用性。【结果】优化后的三重PCR反应体系为ChPV和AIV的上、下游引物各0.5μL,NDV的上、下游引物各1.0μL,NDV、ChPV和AIV的核酸模板各1.0μL,Premix TaqTM 12.5μL,无RNase水补足至25.0μL。最佳扩增程序:95.0℃预变性5 min;94.0℃1 min,58.5℃1 min,72.0℃1 min,进行35个循环;72.0℃延伸10 min,12.0℃结束反应。建立的三重PCR能同时扩增出NDV(453 bp)、ChPV(687 bp)和AIV(239 bp)的特异性条带,对应的最低检测下限分别为2.5 pg NDV、6.4 pg ChPV和2.0 pg AIV,但扩增传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、马立克病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)和禽肺炎病毒(APV)等病原体均呈阴性。应用建立的三重PCR对50份鸡喉头或泄殖腔棉拭子样品进行检测,结果显示有1份NDV阳性、9份ChPV阳性和2份AIV阳性样品,其中包含2份ChPV和AIV均呈阳性的样品,1份ChPV和NDV均呈阳性的样品,与常规PCR的检测结果一致。【结论】建立的三重PCR能同时对NDV、ChPV和AIV 3种病原进行特异性诊断,在混合感染病例鉴别诊断方面具有广阔的应用前景。

禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒二重荧光LAMP检测方法的建立及应用

【目的】建立同时鉴别ALV和CIAV的二重荧光环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速诊断及有效防控ALV和CIAV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考ALV(A亚群、B亚群、C亚群、D亚群和J亚群)的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列,设计2套用于LAMP的特异性引物,并在ALV和CIAV的F1c和B1c覆盖区域分别设计双标记探针[ALV-Probe(5'端标记FAM荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团)和CIAV-Probe(5'端标记CY5荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团)]。在Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应结束后,将反应管置于多色荧光系统内进行观察分析;并通过特异性试验、灵敏度试验及临床样品检测验证二重荧光LAMP检测方法的适用性和可靠性。【结果】优化后的二重荧光LAMP反应体系20.0μL:DNA/cDNA模板2.0μL,2×ReactionMix 10.0μL,Bst DNA聚合酶0.8μL,内引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP(工作浓度40.0μmol/L)各0.8μL,外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3(工作浓度5.0μmol/L)各0.4μL,ALV-Probe(工作浓度0.5μmol/L)0.4μL,CIAV-Probe(工作浓度0.5μmol/L)0.8μL,以ddH_(2)O补足至20.0μL。扩增程序:62℃反应60 min,80℃灭活5 min。建立的二重荧光LAMP检测方法能特异性同时检测ALV和CIAV,对其他禽类病原体无特异性扩增;检测CIAV和ALV单一模板的下限均为102拷贝/μL,检测混合模板时ALV的检测下限为102拷贝/μL、CIAV的检测下限为103拷贝/μL。应用建立的二重荧光LAMP检测方法对13份咽喉和泄殖腔棉拭子样品进行检测,其检测结果与常规PCR检测结果的吻合率达100%。【结论】建立的二重荧光LAMP检测方法能实现在同一反应管内鉴别诊断ALV和CIAV,具有特异性好、敏感性高及污染风险小等优点,且检测结果可通过多色荧光系统进行肉眼观察,适用于ALV和CIAV的临床快速筛查。

小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒多重荧光RT-LAMP鉴别检测方法的建立及应用

旨在建立一种可视化多重荧光RT-LAMP方法用于检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的核酸,并初步应用于小反刍兽疫和蓝舌病临床样品的检测。比对GenBank中小反刍兽疫N基因和蓝舌病NS3基因保守区域,设计2套LAMP引物,在每条内引物FIP的5′端标记荧光基团。对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和干扰性,同时应用该方法检测168份临床样品。结果表明,该方法对小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒高度特异,与口蹄疫病毒、鹿流行性出血热病毒、牛瘟病毒、山羊痘病毒等其他反刍动物病毒均无交叉反应,检测灵敏度为200 copies/μL,干扰性小,可同时检测两个不同浓度的模板。对168份样品的检测结果显示,小反刍兽疫病毒的感染率为3.6%,蓝舌病病毒的感染率为13.1%,无两种病毒混合感染;与荧光RT-PCR方法相比,此多重荧光RT-LAMP方法敏感性为91.7%~100%,特异性为100%。表明建立的多重荧光RT-LAMP可快速、准确地检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒,具有较好的临床应用价值。

卡培他滨联合替吉奥化疗在胰腺癌术后的临床疗效

目的探究胰腺癌患者行手术治疗后卡培他滨联合替吉奥对比卡培他滨单药化疗的临床疗效以及对患者免疫功能的影响。方法对株洲医院于2008年1月至2010年12月收治的48例行手术治疗后的胰腺癌患者进行前瞻性分析,随机分为对照组和观察组,每组24例,对照组采用卡培他滨单药化疗,观察组采用卡培他滨联合替吉奥化疗。采用生活质量核心量表(QLQ-C30)评估患者生活质量,流式细胞仪检测淋巴细胞亚群,ELISA法检测IFN-γ和IL-4水平,再从脱发、骨髓抑制、肾功能损伤、消化道不良反应和神经毒性五个方面分析两组患者的毒副反应,回访分析两组患者的远期生存率。结果观察组化疗后缓解率和总有效率分别为41.67%和70.83%,明显高于对照组的25.00%和58.33%;观察组化疗后2周、4周和8周时生活质量均明显优于对照组;以上差异均具有统计学意义(P<0.01)。观察组联合化疗后的T细胞(CD3^+)、Th细胞(CD3^+CD4^+)、Tc细胞(CD3^+CD8^+)、NK细胞(CD3-CD56^+)和Treg细胞(CD4^+CD25^+)百分率增加,IFN-γ水平上升,IL-4水平降低,与化疗前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。另外,观察组脱发、肾功能损伤、骨髓抑制、消化道不良反应和神经毒性等没有明显增加(P>0.05)。观察组中位生存时间明显长于对照组(25个月vs 10个月);观察组的1、2、3年生存率分别为62.5%、54.2%和45.8%,也明显高于对照组(分别为33.3%、25.0%、16.7%),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论卡培他滨联合替吉奥对胰腺癌术后患者具有较高的化疗效果,可显著改善患者的生活质量,提高远期生存率,且不增加不良反应发生率;同时该方式提高机体免疫功能,可成为手术后胰腺癌患者辅助治疗的有效选择。

IBRV与MB二温式多重PCR检测方法的建立

本研究根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛支原体(MB)的保守基因设计了两对特异引物,建立了可同时检测IBRV和MB的二温式多重PCR检测方法。结果表明,IBRV和MB的扩增长度分别为727bp和412bp,而其他对照病毒的检测结果均为阴性;该方法的IBRV和MB标准品最低检测限均为104拷贝。

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒的二重荧光LAMP方法的建立

建立一种二重荧光LAMP的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV)的快速诊断技术。根据已发表的PRRSV NSP2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域,分别设计并合成了两组针对PRRSV和PCV2序列的特异性引物和两条探针,两条探针分别标记不同的荧光基团,PRRSV-Probe 5’端标记FAM荧光基团,3’端标记BHQ1淬灭基团,PCV-Probe 5’端标记CY5.5荧光基团,3’端标记BHQ2淬灭基团。对组成反应体系中的引物、探针以及反应试剂进行优化,建立了二重荧光LAMP检测PRRSV和PCV2方法。对建立的方法进行特异性和敏感性测试,并用模拟混合样品和临床样品进行检测验证。结果显示,本研究建立的方法可以鉴别区分PRRSV和PCV2,特异性试验表明该方法只检测出PRRSV或PCV2,且与参试的对照病毒无交叉反应,特异性好。敏感性测试表明该方法最低检测PRRSV或PCV为100拷贝,敏感性好。对临床样品的检测,结果与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的PRRSV和PCV2二重荧光LAMP检测方法,具有良好的特异性和敏感性,可用于临床样品中检测PRRSV和PCV2。

血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备

【目的】获得截短表达的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-2重组蛋白及其单克隆抗体,为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。【方法】对Fiber-2基因序列进行密码子优化,截取Fiber-2蛋白抗原性集中片段,PCR扩增其基因序列,连接至pET-32a(+)构建原核表达载体。将表达的重组蛋白进行纯化,并通过Western blotting验证其在大肠杆菌中的表达情况。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠后取脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选阳性细胞株,再利用秋水仙素裂解法、间接ELISA法和间接免疫荧光法(IFA)对其进行鉴定。【结果】成功构建Fiber-2基因截短片段的原核表达系统,获得大小约为67 kD的Fiber-2截短蛋白,以包涵体的形式出现,经纯化后可获得单一的特异性条带,经Western blotting鉴定证明其可与FAdV-4阳性血清结合从而产生一条特异性条带。经过4次亚克隆后筛选到5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株(2C2、4F6、5A5、6G10和10B5),其抗体分泌稳定性、特异性好,诱生的细胞上清液抗体效价为1:1600~1:6400,腹水抗体效价为1:320000~1:1280000,秋水仙素裂解检测染色体数目为94~110条。2C2、4F6和10B5杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG2b亚型,轻链为Kappa链;5A5和6G10杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG1亚型,轻链为Kappa链。5株杂交瘤细胞株与感染FAdV-4的鸡肝癌上皮细胞系(LMH)进行IFA检测,结果均为阳性。【结论】制备的Fiber-2截短重组蛋白及单克隆抗体具有良好的反应原性和特异性,可用于FAdV-4病毒检测试剂盒研发。

鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

【目的】构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础。【方法】采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建cDNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析。【结果】构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×10^6CFU,文库滴度为3.1×10^8 CFU/mL,插入片段大小集中在300~2000bp,重组率为91.67%。以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9)。【结论】通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARV σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据。