低压养护下低热水泥混凝土的性能研究

研究了不同养护(低压养护、标准养护)条件下掺不同品种水泥(普通硅酸盐水泥OPC、低热水泥LHPC)混凝土的性能,分析了LHPC混凝土的孔结构对其性能的影响。结果表明:相同养护条件下,LHPC混凝土的后期抗压强度高于OPC混凝土;低压养护条件下,LHPC的放热量远低于OPC,LHPC可以持续进行水化,对低压环境的适应性更好,LHPC混凝土的孔结构更加致密,LHPC混凝土的耐久性能更好;混凝土的耐久性能与孔结构呈线性关系,且耐久性能随着孔结构的劣化而降低。

干酪乳杆菌YG-01株的益生特性及抑菌活性研究

[目的]评价从奶酪中分离出的干酪乳杆菌YG-01的益生性及抑菌活性,为该菌株在食品动物生产中的应用提供理论参考。[方法]本研究分别检测干酪乳杆菌YG-01株的药物敏感性、肠道定植能力、消化道环境耐受特性、肠道菌群调节作用、抑制肠道致病菌活性及促生长作用。[结果]药敏试验结果显示,干酪乳杆菌YG-01对米诺环素、红霉素、克拉霉素、克林霉素、青霉素等常见抗生素极敏感;利用探针(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester, cFDA-SE)标记的干酪乳杆菌YG-01灌喂试验兔,口服后第1天,干酪乳杆菌YG-01在兔空肠、回肠和结肠的检出率分别为70.9%、59.3%和66.0%,口服后第11天时仍保持较高定植水平(>35%);干酪乳杆菌YG-01的活菌数在模拟胃液(pH为2.5、3.5、4.5)、模拟肠液、胆酸盐浓度<2 g/L及在9%NaCl溶液中均高于1×105CFU/mL;体外抑菌试验结果显示,干酪乳杆菌YG-01能显著抑制大肠埃希菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌、沙门菌、志贺菌、副溶血弧菌等肠道致病菌生长,而对益生菌罗伊乳杆菌无抑制作用;口服干酪乳杆菌YG-01能极显著提高兔的平均日采食量和平均日增重,还可显著抑制厚壁菌门和疣微菌门细菌增殖。[结论]干酪乳杆菌YG-01株具有良好的益生性,可显著抑制肠道致病菌的增殖,改善食品动物生长性能,为开发基于干酪乳杆菌YG-01株的微生态制剂奠定了基础。

极地重型破冰船结构设计特点浅析

极地重型破冰船是极地航路开辟、救援支援、科学考察及资源开发的重点保障装备。与中低冰级极地船型/破冰船相比,由于其高冰载荷作用环境特点,该船型在高强度钢/特种材料应用、冰载荷作用下结构安全评估以及船体结构布置设计等方面有其鲜明特征,需予以重点考虑,不可武断地沿用以往针对中低冰级极地船型的结构设计经验。该文以某型PC2级极地重型破冰船型为例,总结其结构设计/评估经验,重点就冰区构件高强度结构钢应用、冰区外板复合钢板应用需求与特点、非线性评估技术应用对冰区构件尺度影响、冰致剪力/弯矩分布特点及其对主船体内部平台、桥楼侧壁等非冰带区构件设计影响展开讨论,阐明此类船型结构设计特点及其与中低冰级极地船型/破冰船在整体结构布置思路、冰区结构设计评估方面的主要区别。文中认为:随着冰级的升高,冰载荷的影响已不仅仅局限于冰区外板及其附连构件区域,在冰区构件材料选型及整船全局性结构布置、设计等方面也会产生重大影响。

江西庐山星子群片麻岩的变质年龄和变质机制:独居石和锆石SIMS年代学

江西庐山地区星子群片麻岩的构造属性对认识江西甚至华南的大地构造具有重要意义。对星子群片麻岩穹窿不同构造部位的4个片麻岩中独居石进行高精度SIMS U-Pb年龄测定,结果显示它们的206Pb/238U加权平均年龄分别为141.0±1.0 Ma、143.0±1.0 Ma、143.5±1.0 Ma和144.2±1.6 Ma,因此将星子群的峰期变质时代限定于141.0~144.2 Ma。同时本文首次报道了庐山观音尖辉长岩的锆石SIMS U-Pb定年,确定其侵位年龄为141.1±1.5 Ma,这与星子群片麻岩独居石获得的峰期变质年龄在误差范围内一致。结合星子群的变质温度和变质分带特征,推测庐山片麻岩穹窿可能是中生代岩浆热穹窿,其角闪岩相的变质作用可能是岩浆热动力变质的产物。本研究不仅为庐山地区构造变形属性的厘定提供了详实的定年证据,还能为中国东部中生代板内强烈变质变形的研究提供重要参考。

江西庐山地区中生代飞来峰构造的厘定:同位素年代学和地质构造证据

通过对庐山地区前寒武纪地层系统的同位素年代学测定,建立庐山地区前寒武纪地层年代学框架,结合详细野外地质构造研究和显微构造分析,本文厘定了庐山地区中生代大型飞来峰构造。该飞来峰外来系统为汉阳峰一带出露的庐山垄群火山岩系,2个火山岩样品的锆石年龄分别为840±4 Ma和828±4 Ma,大致限定了该火山岩系的形成年龄;原地系统为汉阳峰山下广泛分布的星子群和板溪群,6个变沉积岩样品的碎屑锆石年代学数据指示原地系统地层的最大沉积年龄小于810~790 Ma,显示飞来峰外来系统和原地系统的层位关系已经发生倒置。庐山飞来峰下伏构造推覆面在其东南侧为韧性剪切带,发育糜棱岩和构造片岩,其中的矿物拉伸线理和长石碎斑系等运动学标志显示其逆冲推覆方向为由SW往NE。该飞来峰现今的长约12~15 km,宽约3~6 km,面积约为50 km^(2),最小推覆距离为15 km。根据推覆构造韧性剪切带内单矿物年代学推测其推覆时间在140 Ma左右,这既为华南地区燕山运动B幕时间提供了关键证据,也佐证华北、华南地区燕山运动B幕的一致性。庐山中生代飞来峰构造的厘定对中国东部燕山运动性质和板内造山形成机制具有重要科学意义。

新疆白龙山伟晶岩型锂矿床研究进展

大红柳滩-白龙山一带是西昆仑-喀喇昆仑山花岗伟晶岩分布最为集中、稀有金属矿化最好的地区。项目组2017年通过多次野外勘查、系统取样与室内化验分析,确认在新疆和田县喀喇昆仑腹地白龙山新发现了一处超大型锂铷多金属矿床,该矿床为花岗伟晶岩型。同时在大红柳滩-白龙山发现了雪凤岭、雪盆、双牙、冰舟、白龙山南、大红柳滩东(496北沟)等多处花岗伟晶岩型锂多金属矿床。通过对白龙山锂多金属矿床研究,目前已确定含矿伟晶岩脉群带长度>8250 m,宽度46~165 m,在白龙山锂多金属矿区划分出5个含矿伟晶岩脉群带,共发现含矿伟晶岩脉166条,对其中52条主要矿体进行了研究,含矿伟晶岩脉长度50~1230 m,宽1.5~157 m不等,Li2O平均品位0.93%~3.44%,BeO平均品位0.54%~0.63%,Rb_(2)O平均品位0.11%~0.18%,Nb2O5平均品位0.011%~0.018%,Ta_(2)O_(5)平均品位0.003%~0.009%。新疆昆仑蓝钻矿业开发有限责任公司第一期勘探对部分区段进行勘查,目前勘探一期控制资源量Li_(2)O超过60万t,达到超大型规模。项目组预测白龙山矿床潜在资源量Li_(2)O为506万t,伴生BeO为16万t,Rb_(2)O为31万t,Nb_(2)O_(5)为4万t,Ta_(2)O_(5)为1.75万t,有望成为一个世界级规模的巨型锂多金属矿床。白龙山锂矿伟晶岩脉群,以二云母花岗岩为中心向北和向南存在对称的伟晶岩脉群分带现象,该矿床形成于碰撞造山环境,与典型的LCT和NYF型锂矿不尽相同,具有独自特点,提出白龙山锂矿为LRN(Li-Rb-Nb)型锂矿的新观点。

长白山火山下方地幔转换带中滞留的俯冲太平洋板块存在空缺吗?

针对近年来长白山火山下方地幔转换带中是否存在低波速异常指示的太平洋板块"空缺"而引起的不同科学认识的热烈辩论,本文主要回顾了我国东北地区地幔转换带的体波成像结果。使用相对走时残差的远震体波成像结果显示,长白山火山以西地幔转换带中存在低波速异常指示的太平洋板块"空缺";而使用绝对走时残差的区域成像和全球成像结果,尽管展示出长白山火山以西比以东略低的波速异常,但长白山火山以东至我国东北重力梯度带区域下方的地幔转换带均展示出明显的连续的高波速异常。在接收函数分析时,如果以全球平均值660km而非我国东北地区平均值670km作为基准,来分析660km间断面是抬升还是下沉;以全球平均值250km而非我国东北地区平均值260km作为基准,来分析地幔转换带是增厚还是减薄的话,则可以得到长白山火山以东至我国东北重力梯度带区域660km间断面下沉与地幔转换带增厚的认识。这种与绝对走时残差成像结果展示的地幔转换带为连续的高波速异常结果相一致的结果,说明太平洋板块俯冲前缘已由日本海沟抵达我国东北松辽盆地与大兴安岭交界处。结合高温高压实验、数值模拟与岩石地球化学研究结果,本文并不支持长白山火山以西的地幔转换带存在低波速异常指示的板块"空缺"和地幔转换带"减薄"的认识。长白山火山的深部起源与太平洋板块深俯冲至我国东北松辽盆地与大兴安岭交界处形成的"大地幔楔"结构动力学相关。

基于传递路径分析法的船舶舱室噪声预报研究

基于传递路径分析法结合房间声学常数对船舶舱室噪声进行预报,噪声传递路径传递损耗按照空气噪声和结构噪声分别计算,结合房间常数计算接收点舱室噪声声压级。以传递路径分析法为基础,提出舱室噪声预报的通用计算流程,结合数值计算(SEA)方法确定及优化传递路径分析法中的重要计算参数(传递损耗及传递函数),并通过某内河汽车运输船舱室噪声预报实例,发现基于此方法的计算预报值与实测值吻合良好,验证了其计算参数的可靠性,从而提高了该方法的计算精度。

火山学研究的问题与进展

二十一世纪的地球科学进入了新的发展阶段，从对各领域相对孤立的探索转而强调自然对人类环境的影响，愈加关注地球各部分之间的内在联系。目前达成的共识有，地球运行的源动力来自地球内部，地球内部运行控制了表层系统的演变。

南海大洋钻探及海洋地质与地球物理前沿研究新突破

南海是西太平洋地区规模最大且具有代表性的边缘海盆地之一。经过近几十年的研究积累,尤其是通过实施5个国际大洋钻探航次(1999–2018年)与国家自然科学基金委“南海深海过程演变”重大研究计划(2011–2019年),我国科学家获得了大量宝贵的第一手资料,取得了一系列创新进展与重大突破,标志着南海海洋地质与地球物理研究正走向国际前沿。重要研究成果包括:(1)新提出南海是“板缘张裂”盆地,与经典的大西洋型陆缘模式不同;(2)大洋钻探首次获取了基底玄武岩样品,结合中国在南海首次深拖地磁测量实验,精确测定了南海海盆玄武岩年龄,揭示南海海盆从东向西分段扩张;(3)大洋钻探结果发现南海陆缘岩石圈减薄之初岩浆迅速出现,未发现缓慢破裂造成的蛇纹岩出露;(4)发现南海扩张结束后仍存在大量岩浆活动,可能受控于多种构造与地幔因素;(5)地球化学证据与地球动力学模拟都显示南海岩浆的形成受到周边俯冲带的影响。目前我国的海洋地球科学正在进入崭新的发展阶段,有望以南海为基点,开始拓展到周边大洋,通过主导大型研究计划以及建设我国大洋钻探平台,以提升我国在南海、西太平洋与印度洋海洋地质科学研究的实质性影响力与引领地位。

华南地区二叠纪-三叠纪界线酸性火山灰的源区与规模

华南地区二叠纪-三叠纪之交(Permian-Triassic Boundary,简称PTB)火山灰与生物灭绝事件在地层层位上高度相关,可能是灭绝事件的触发因素之一,对其成因、来源和规模的研究具有重要科学意义。本研究在对广西来宾地区蓬莱滩剖面大隆组顶部凝灰质砂岩岩相学研究的基础上,通过碎屑锆石年代学、Hf同位素及微量元素的分析,结合华南地区PTB凝灰岩和火山粘土岩时空分布特征对其源区和规模进行讨论和限定。蓬莱滩剖面大隆组顶部2个凝灰质砂岩样品中81%的碎屑锆石U-Pb年龄集中在235±2.7Ma^258±4.8Ma之间,呈现出~252Ma的单一峰值;11%的锆石年龄为260±3.2Ma^276±3.6Ma;年龄为294±5.8Ma^561±6.9Ma的锆石6颗;元古宙锆石5颗,最老年龄为2063±13.4Ma。样品中晚二叠世碎屑锆石的Hf同位素表现出地壳来源特征,除一颗锆石值为+10.3外,其余均落在-16.5^-5.0之间,与华南PTB典型剖面基本一致。碎屑锆石U-Th-Hf-Nb微量元素特征显示其具有来源于大陆岩浆弧的属性。蓬莱滩剖面凝灰质砂岩中存在大量粒径0.5~2mm的晶屑,部分粒径甚至达到3mm,这些粗粒火山碎屑物暗示该剖面距离火山口源区较近。蓬莱滩剖面火山碎屑物的锆石U-Pb年龄和地层位置与华南PTB火山灰基本一致,并具有相似的锆石Hf同位素和微量元素特征,表明两者可能来自同一源区。在空间分布上,华南地区PTB附近的火山碎屑沉积岩和较粗的凝灰岩仅出现在华南的西南部,而华南北部主要分布粒度小于0.3mm的细粒火山灰,火山碎屑粒度由西南向东北逐渐减小的规律表明火山物质来源于华南西南缘。近年来,包括海南岛二叠纪花岗岩及桂西南酸性火山岩在内的众多证据表明华南板块西南缘存在一个二叠纪大陆岩浆弧。因此,本文提出华南PTB火山灰可能来源于华南板块西南缘古特提斯大陆岩浆弧。PTB火山灰仅分布在华南地区,在华北、西北等地区均未发现或报道同时期的火山灰,说明与这次俯冲作用相关的弧岩浆火山喷发规模有限,推测其不是触发全球性PTB生物灭绝事件的主要原因。

植物乳杆菌噬菌体Lpla的分离鉴定及抗噬菌体菌株的筛选

从泡菜中分离得到1?株以植物乳杆菌WCFS1为宿主菌的烈性噬菌体,命名为Lpla。一步生长曲线结果表明Lpla的潜伏期为15 min,裂解期为180 min,裂解量为43 PFU/cell。根据透射电镜观察的形态将其归为长尾病毒科,B1类。噬菌体的理化性质结果表明,Lpla对酸、碱的耐受性较强,对乙醇、温度和紫外射线的耐受性较低。吸附实验结果显示,Lpla在4℃时吸附率最大。Ca2+、Mg2+均可促进Lpla对宿主菌的吸附,热灭活宿主菌可使Lpla的吸附率下降20%。本研究筛选出6株对噬菌体Lpla具有稳定抗性的植物乳杆菌,为制定出有效的噬菌体防治策略提供理论依据,并为进一步将抗性菌株应用于生产实践奠定基础。

表达乳铁蛋白肽的猪源罗伊氏乳酸杆菌对断乳仔猪抗霍乱沙门菌感染的效果分析

旨在分析表达牛乳铁蛋白肽的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21作为饲用微生态制剂对仔猪促生长与抵抗猪霍乱沙门菌感染的作用。将该重组菌连续饲喂28日龄断乳仔猪21 d,并设立空菌组、对照组以及抗生素组。第21天时对断乳仔猪连续口服感染猪霍乱沙门菌3 d,并设置7 d的观察期;仔猪感染后采集试验组与对照组血清、肠黏液及肠组织。检测结果显示重组菌组仔猪平均日增重与免疫器官指数均显著提高(P<0.05),料重比极显著降低(P<0.01)。感染猪霍乱沙门菌后,相对于对照组,重组菌组仔猪日增重提高,腹泻率降低;重组菌组仔猪血液中IgG以及肠黏液中IL-4、sIgA的量极显著提高(P<0.01),IL-2、IL^(-1)2、IL-6的量显著降低(P<0.05);重组菌组仔猪肠道紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1的基因转录水平和TLR4、Myd88和MLCK的基因转录水平极显著提高(P<0.01),仔猪肠道内猪霍乱沙门菌的数量极显著降低(P<0.01);重组菌组与抗生素组无明显差异(P>0.05)。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21可以提高断乳仔猪的生长性能、促进肠道形态发育、增强肠道屏障功能,并且在一定程度上可以保护仔猪免受猪霍乱沙门菌的感染,表明重组菌作为微生态制剂替代断乳仔猪的饲用抗生素具有一定的应用前景。

表达猪乳铁蛋白肽重组屎肠球菌对断奶仔猪生长性能的影响及其抗ETEC感染效果研究

本试验以表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌(pNZ8112-PLFcin/Ef)饲喂断奶仔猪,研究其对仔猪生长性能的影响和抗产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)感染的效果。选取28日龄体重相近的健康断奶仔猪36头,随机分为3组(重组屎肠球菌组、空载体组和培养基组),每组3个重复,每个重复4头仔猪。重组屎肠球菌组和空载体组分别饲喂添加pNZ8112-PLFcin/Ef(6×1012 CFU/kg)和pNZ8112/Ef(6×1012 CFU/kg)的基础日粮,而培养基组饲喂含有相同体积的GM17液体培养基的基础日粮。试验期26d。结果显示,与培养基组相比,重组屎肠球菌组断奶仔猪的平均日增重极显著提高(P<0.01);料重比显著降低(P<0.05);腹泻率明显降低,肠道菌群的均匀度和多样性指数均下降。为进一步探究表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌对断奶仔猪抵抗ETEC感染的保护作用,在连续饲喂21d后,每个重复中随机挑选1头体况相近的断奶仔猪灌服ETEC。结果发现,与培养基组相比,攻菌后重组屎肠球菌组断奶仔猪血清白细胞介素-2(IL-2)、免疫球蛋白G(IgG)含量、肠黏液中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平均显著升高(P<0.05);脾脏指数显著提高(P<0.05),但胸腺指数、肠段长度及重量则均无显著差异(P>0.05)。综上所述,表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌能够起到促进断奶仔猪生长及抗ETEC感染的保护作用。

重组猪源罗伊氏乳酸杆菌分泌表达牛乳铁蛋白肽对新生仔猪生长性能的影响以及抗腹泻病毒感染的保护作用研究

本试验旨在研究分泌表达牛乳铁蛋白肽(LFCA)的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌对新生仔猪生长性能的影响以及对引起仔猪腹泻的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染的保护作用。试验1:选取36头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为3组,分别为重组菌组、空载菌组和对照组,每组12头仔猪,分别口服表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA/LR-CO21、含有空载体质粒的重组猪源罗伊氏乳杆菌pPG/LR-CO21和磷酸盐缓冲液(PBS)各4 mL,连续口服3 d,口服后观测时间为14 d。期间仔猪自由采食,记录各组仔猪体重变化和腹泻情况。试验2:选取30头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为5组,分别口服1、3、6、9、12 mL半数组织培养感染剂量(TCID 50)为10-7.50/mL的TGEV。设置7 d时间为观察期,分析半数致死量的条件。试验3:另选取1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪32头,随机分为4组,分别为重组菌组、空载菌组、对照组、TGEV感染组,每组8个重复,每个重复1头仔猪。试验组每天每头按照2×1010 CFU的剂量口服pPG-LFCA/LR-CO21、pPG/LR-CO21及等体积的PBS,连续口服饲喂1周,在8日龄按照半数致死量口服TGEV感染,感染7 d后进行样品采集。记录各组仔猪体重变化和腹泻情况;苏木精-伊红(HE)染色检测小肠绒毛高度及隐窝深度;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测仔猪血清中总免疫球蛋白G(IgG)和肠黏液总分泌型免疫球蛋白A(sIgA)抗体含量;实时荧光定量PCR检测紧密连接蛋白相关基因封闭蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)和紧密连接蛋白-1(ZO-1)以及炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及Toll样受体2(TLR2)的mRNA相对表达量;对仔猪盲肠内容物进行菌群结构分析。结果表明:口服重组猪源罗伊氏乳酸杆菌后,与对照组相比,重组菌组新生仔猪的平均日增重极显著提高(P<0.01),而腹泻率降低且差异极显著(P<0.01);与TGEV感染组相比,重组菌组仔猪平均日增重增加且腹泻率降低,差异显著(P<0.05);空肠和回肠绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度的比值显著增加(P<0.05);仔猪血清中总IgG和肠黏液总sIgA抗体含量显著升高(P<0.05);肠黏膜组织中紧密连接蛋白相关基因Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01),血清中细胞因子TNF-α含量极显著降低(P<0.01),血清IFN-γ、IL-6、IL-8、TLR2含量极显著升高(P<0.01),仔猪存活率提高。对仔猪盲肠内容物进行菌群多样性分析结果显示,TGEV感染仔猪后肠道正常菌群占比下降,相比于TGEV感染组,口服重组菌的仔猪肠道菌群致病菌拟杆菌属占比下降,差异显著(P<0.05),菌群多样性更接近对照组,肠道菌群的代谢、遗传信息处理等功能均有所增强。综上所述,本试验成功构建了分泌表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌菌株,经口服途径饲喂新生仔猪后,能够促进仔猪生长,降低新生仔猪的腹泻率,经口服途径饲喂感染TGEV的新生仔猪后,可以改善肠道环境,降低病毒对仔猪肠道的损伤,对仔猪抗TGEV感染提供有效保护。

发酵过程中不同理化因素对乳酸菌噬菌体的影响

乳酸菌已被广泛应用于食品和生物制品生产中,但由于噬菌体污染普遍存在,引起发酵过程减慢、周期延长,甚至导致发酵失败,造成严重的经济损失。通过对发酵介质中不同理化因素对噬菌体及宿主菌的影响分析,结果表明,噬菌体对高温较敏感,56℃处理噬菌体Lc、Lpen及Lbre,分别于20、45 min及10 min后全部灭活;噬菌体对酸、碱有较强的耐受性,在pH=3~12范围内噬菌体活性相对稳定,宿主菌在pH=4~9范围内活性相对稳定。对二价阳离子Ca^(2+)或Mg^(2+)影响的检测结果表明,宿主菌在MCM、MRS-Ca、MRS-Mg、MRS培养基中均能正常生长,而噬菌体Lc、Lpen、Lbre在未添加Ca^(2+)或Mg^(2+)条件下,效价下降了2~4个数量级。发酵介质添加T-20(0.1%、1%、2%)时,当T-20浓度增加到2%时,宿主菌仍可正常生长,噬菌体Lc效价下降3个数量级,噬菌体Lpen和Lbre可完全灭活。发酵介质添加不同浓度NaCl(1%、2%、3%和5%)时,宿主菌均能正常生长,当NaCl添加量为5%时,噬菌体Lc效价下降2个数量级,噬菌体Lpen可完全灭活,Lbre耐受性较强,不能被灭活。

重组牛α干扰素的分泌表达及抗病毒活性分析

本研究旨在利用乳酸乳球菌构建牛α干扰素(BoIFN-α)的分泌表达系统并分析其抗病毒活性。根据乳酸乳球菌MG1363密码子使用的偏好性,对BoIFN-α基因进行优化合成。将目的基因和乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399分别进行SalⅠ和BglⅡ双酶切,将胶回收产物进行连接后,转化大肠杆菌TG1感受态细胞,提取阳性质粒电转化乳酸乳球菌感受态细胞,用SDS-PAGE和Western blotting方法对表达蛋白进行分析和鉴定,同时将重组乳酸乳球菌培养28 h后取上清用PEG20000浓缩10倍左右,进行体外抗病毒试验。结果显示,试验成功构建了重组乳酸乳球菌pAMJ399-BoIFN-α/MG1363,重组菌上清和沉淀均出现约20 ku的目的条带,表明重组蛋白以分泌的形式同时存在于培养液的上清和沉淀中。浓缩后的重组BoIFN-α(rBoIFN-α)上清与水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)同时作用,用MDBK/VSV系统以微量细胞病变抑制法测定rBoIFN-α的效价为1.02×106 U/L;通过Alamer Blue法分析可知,加入rBoIFN-α后对细胞的活性影响较小;间接免疫荧光试验可见加入rBoIFN-α后细胞无绿色荧光,说明rBoIFN-α有良好的抗病毒效果;实时荧光定量PCR结果进一步证实rBoIFN-α具有一定的抗病毒效果。本试验构建了能分泌表达rBoIFN-α的乳酸乳球菌,通过一系列的体外抗病毒试验证明rBoIFN-α具有良好的抗病毒活性,试验结果为rBoIFN-α作为抗病毒药物、免疫增强剂的开发、肽类用药及临床应用提供新途径。

表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌在小鼠诱导的免疫应答分析

旨在构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri,L.reuteri),并评价其在小鼠体内诱导的免疫应答效果。利用PCR扩增实验室分离保存的PCV2b型毒株的cap蛋白基因,以猪源L.reuteri为宿主菌,构建表达cap蛋白的重组菌株pPG-T7 g10-PPT-cap/L.reuteri,通过口服免疫BALB/c小鼠。采用间接ELISA方法测定免疫后小鼠血清中抗原特异性IgG抗体水平,粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中抗原特异性sIgA抗体水平,小鼠血清中各细胞因子水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平;流式细胞技术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4^+T细胞、CD8^+T细胞的水平;荧光定量PCR检测免疫后攻毒的小鼠体内器官的病毒载量。结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组(P<0.01);小鼠粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中sIgA抗体水平显著高于对照组(P<0.01);小鼠血清中细胞因子水平和对照组相比,IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平升高,IL-10水平降低,IFN-α无显著变化;体外孵育PCV2和小鼠脾淋巴细胞结果表明,重组乳酸菌组小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数显著高于对照组(P<0.01);流式细胞技术检测结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠脾细胞中CD4^+T细胞、CD8^+T细胞含量高于对照组;荧光定量PCR结果显示,相比于对照组,口服免疫重组乳酸菌组小鼠体内的病毒载量明显低于对照组。综上所述,本研究成功构建了表达PCV2 cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌,经口服途径免疫动物,构建的重组乳酸杆菌能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,且具有一定的免疫保护效果。

表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌微胶囊制备工艺的优化

为使重组乳酸乳球菌在发酵生产后便于存储、运输,本试验利用可表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363制备微胶囊,优化微胶囊的制备工艺条件,并对胶囊化后重组菌的相关生物学特性进行检测。通过对不同壁材及壁材浓度进行控制单一变量试验,测定其包埋量,以筛选出最佳壁材及浓度。通过模拟胃肠液环境试验,比较微胶囊释放率,并对不同壁材进行保存期试验,比较最低活菌数,利用响应面试验确定最佳工艺条件,使用最佳工艺条件制备微胶囊后进行验证。优化后的结果为:选取海藻酸钠和壳聚糖作为壁材,在海藻酸钠浓度为2.49%,壳聚糖浓度为0.96%,CaCl_(2)浓度为6.67%,凝固时间为57 min的条件下微胶囊效果最佳,预测包埋量为7.85×10^(8) CFU/g。微胶囊在模拟胃液中稳定存在,在模拟肠液中可完全破裂,能释放出微胶囊内95%以上的乳酸乳球菌。海藻酸钠-壳聚糖微胶囊在4℃保存3周后,微胶囊中活菌数为1.41×10^(7) CFU/g。对微胶囊的最佳工艺条件验证结果为微胶囊的包埋量为8.08×10^(8) CFU/g;常温保存2周后,活菌数仍可达到3.89×10^(6) CFU/g;ELISA方法检测微胶囊内重组乳酸乳球菌可见表达的牛乳铁蛋白肽,抑菌试验可见微胶囊内重组乳酸乳球菌表达的牛乳铁蛋白肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌仍具有明显的抑制作用。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌可制备成为低成本、保存期长、耐胃液的微胶囊,为重组乳酸菌在生产中的进一步应用奠定基础。

乳酸菌噬菌体的分离及生物学特性鉴定

为了解乳酸菌噬菌体的生物学特性,并为制定乳酸菌发酵生产过程中噬菌体污染的防控措施提供试验数据和参考,本研究通过斑点试验和双层琼脂平板法,以干酪乳杆菌(L.casei)ATCC 393、戊糖乳杆菌(L.pentosus)KLDS 1.0413、短小乳杆菌(L.brevis)ATCC 367为指示菌从乳制品、泡菜样品中分离乳酸菌噬菌体,通过透射电镜观察噬菌体形态,噬菌体基因组限制性内切酶作用分析其包装机制,并进行宿主范围和一步生长曲线的测定,SDS-PAGE分析噬菌体结构蛋白,对获得的噬菌体进行生物学特性鉴定。结果显示,分离获得3株烈性乳酸菌噬菌体,依次命名为Lc、Lpen和Lbre。电镜结果显示,噬菌体Lc、Lpen均由多面体头部和非收缩性尾部组成,而噬菌体Lbre由多面体头部和收缩性尾部组成。根据形态学分析,Lc和Lpen属于长尾噬菌体科(Siphoviridae),B1类,Lbre属于肌尾噬菌体科(Myoviridae),A1类。噬菌体基因组经限制性内切酶作用后,核酸电泳结果显示,噬菌体Lc、Lpen基因组均为异质平末端,其包装机制属满头包装,即pac-型,而Lbre含有黏性末端,其包装机制属于cos-型。宿主范围测定结果显示,噬菌体Lc、Lbre对宿主专一,而Lpen宿主谱较广。一步生长曲线显示,噬菌体Lc、Lpen和Lbre潜伏期分别为60、45和150 min,裂解期分别为45、90和105 min,裂解量分别为47、24和30 PFU/cell。SDS-PAGE分析显示,噬菌体Lc结构蛋白有7个,主要结构蛋白分子质量约为50 ku;噬菌体Lpen和Lbre结构蛋白均有5个,主要结构蛋白分子质量分别约为55和50 ku。综上,本研究分离获得3株乳酸菌烈性噬菌体,并对其主要生物学特性进行鉴定,对了解乳酸菌噬菌体及后续乳酸菌噬菌体污染的防治提供了试验数据和理论依据。