一种新型冠状病毒双抗夹心ELISA检测方法的建立及评价

新型冠状病毒感染人体后可引起发热、咳嗽等呼吸道症状,重症者可发生新型冠状病毒肺炎、严重急性呼吸综合征、甚至死亡。因此,快速、准确的识别新冠病毒的感染者,对于阻止病毒的持续传播非常重要。目前,新冠病毒抗原检测试剂产品大多以单个新冠病毒的N蛋白为目标抗原,存在一定的假阴性情况,本研究使用可识别多个新冠病毒结构蛋白抗原表位的多抗建立了一种双抗夹心ELISA方法,有望提高新冠病毒抗原检测的敏感性。利用课题组前期设计的一种新冠病毒抗原表位融合蛋白作为免疫原,搭配弗氏佐剂免疫新西兰大白兔,分析兔血清抗体的分泌情况及效价。利用制备的兔源多抗作为捕获抗体,以HRP标记的兔源多抗作为酶标抗体,建立一种用于检测新冠病毒抗原的双抗夹心ELISA检测方法。分别确定最佳捕获抗体、酶标抗体的稀释度以及最佳封闭液种类、封闭时间,初步评价方法的灵敏度和特异性,并比较不同样品储存条件对该ELISA方法检测效果的影响。新冠病毒抗原表位融合蛋白免疫兔后产生了高效价的特异性抗体,经纯化获得了相应的多抗。所建立的双抗夹心ELISA方法具有较好的检测限和线性范围,与常见的呼吸道病原体无交叉反应,有望用于新冠病毒的抗原检测。

针刺“脐四边穴”对慢性失眠及其并发症的影响

目的:观察针刺“脐四边穴”对慢性失眠及其并发症的影响。方法:将120例慢性失眠患者随机分为观察组(60例,脱落8例)和对照组(60例,脱落5例)。观察组在常规取穴(百会及双侧神门、内关、安眠)的基础上配合“脐四边穴”进行针刺治疗,对照组仅取常规穴位针刺治疗,均每日1次,一周6次,共治疗3周。观察两组患者治疗前后及治疗后1个月随访时匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)和失眠严重程度指数(ISI)评分,治疗前后Beck焦虑量表(BAI)、Beck抑郁量表(BDI)、疲劳严重度量表(FSS)、Epworth嗜睡量表(ESS)评分,并应用多导睡眠记录仪观察两组患者治疗前后多导睡眠图(PSG)睡眠参数[睡眠潜伏期(SL)、觉醒时间(AT)、睡眠效率(SE)、实际总睡眠时间(TST)]。结果:两组患者治疗后及随访时,PSQI和ISI评分均较治疗前降低(P<0.05),且观察组低于对照组(P<0.05)。治疗后,两组患者BAI、BDI、FSS和ESS评分均较治疗前降低(P<0.05),且观察组低于对照组(P<0.05)。治疗后两组患者SL、AT较治疗前降低(P<0.05),SE、TST较治疗前升高(P<0.05);观察组SL、AT低于对照组(P<0.05),SE、TST高于对照组(P<0.05)。结论:在常规取穴基础上,针刺“脐四边穴”可提高慢性失眠患者睡眠质量,减轻失眠严重程度,改善并发的焦虑、抑郁、疲劳和嗜睡症状。

肺炎克雷伯菌三个外膜蛋白融合蛋白的原核表达和免疫原性分析

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)是重要条件致病菌之一,它是社区获得性和院内感染相关的重要病原体,可导致肺炎、尿路感染、败血症、肝脓肿等。目前KP多重耐药问题严峻,开发疫苗预防其感染尤为必要。外膜蛋白是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子之一,OMPA、OMPN、CusC富含大量保守区,是研制KP疫苗的理想候选蛋白。该研究通过原核系统表达重组肺炎克雷伯菌抗原表位融合蛋白,并对其免疫原性进行验证。通过计算机分析筛选出KP外膜蛋白OMPA、OMPN、CusC高度保守的抗原表位,将多个表位串联成融合蛋白,构建大肠杆菌重组系统表达KP融合蛋白,用镍离子螯合层析技术纯化目的蛋白,蛋白配伍不同的佐剂分组免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价及相关细胞因子水平以评价融合蛋白诱导的体液免疫和细胞免疫效果,对比各组之间免疫效果的差异,筛选最佳免疫方案。表达出的重组融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经变复性处理后得到可溶性的融合蛋白;重组融合蛋白免疫小鼠后产生了高效价特异性抗体,搭配佐剂可以提高抗体效价,其中MF59佐剂和CpG佐剂增强作用最好,其次是铝佐剂;免疫后的小鼠可产生细胞免疫,搭配佐剂可以提高细胞免疫的效果,其中MF59佐剂的促进作用最优,其次是CpG佐剂,再者是铝佐剂。本研究设计的肺炎克雷伯菌融合蛋白具有良好的免疫原性,能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答,搭配佐剂可显著增强免疫效果,为亚单位疫苗的研制奠定了基础。

扩心方对阿霉素诱导扩张型心肌病大鼠心脏血管新生作用的影响

目的观察扩心方对阿霉素诱导扩张型心肌病大鼠心脏血管新生作用的影响。方法应用腹腔注射阿霉素诱导扩张型心肌病大鼠模型,60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、扩心方低[1.8 mg/(kg·d)]、中[3.6 mg/(kg·d)]、高剂量组[7.2 mg/(kg·d)]及卡托普利组[5 mg/(kg·d)]。各组分别给予药物或生理盐水灌胃4周。造模结束后采用超声心动图检测大鼠心脏功能;HE、Masson染色观察大鼠心肌组织病理学改变;免疫组化观察大鼠心肌组织VEGF、α-SMA、CD31、CD34表达情况;Western blot观察大鼠心肌组织VEGFR-2蛋白表达水平。结果与正常组相比,模型组大鼠LVIDD及LVIDS值升高,EF及FS值降低(P<0.05),与模型组大鼠相比,扩心方高、中、低及卡托普利组大鼠LVIDD、LVIDS值降低,EF、FS值升高(P<0.05);与模型组相比,扩心方低、中、高剂量组及卡托普利组VEGF、CD31、CD34表达明显增加,且CD34表达呈剂量依赖性;扩心方高剂量组α-SMA较模型组表达增加明显;扩心方低、中、高剂量组及卡托普利组VEGFR-2蛋白表达较模型组均升高,其中扩心方低、中剂量组及卡托普利组升高显著(P<0.01)。结论扩心方可通过上调促血管新生因子VEGFR-2表达,增加阿霉素诱导扩张型心肌病大鼠心肌微血管密度,促进血管生成。

5种腺病毒通用型抗原表位融合蛋白的设计制备及检测试剂的研发

人腺病毒(Human adenovirus,HAd Vs)可引起包括急性呼吸道感染、胃肠炎、流行性角结膜炎等多种人群疾病。其中儿童、新兵及免疫力低下人群是最易感人群。到目前为止,HAd V-B3、B4、B7和新近出现的14型、55型等基因型,常导致严重肺炎。目前美国FDA批准在17~50岁的军人中使用口服4型和7型腺病毒活疫苗,大量的临床试验和正在进行的发热性呼吸道疾病监测均证明此口服活疫苗是安全和高效的。然而,目前没有批准在儿童和成人中普遍使用的疫苗。六邻体蛋白是腺病毒主要的抗原蛋白,该蛋白前中段含有大量的保守区,有很好的抗原性,是制备通用型腺病毒疫苗的重要候选蛋白,也是研制抗体检测试剂的理想抗原。本研究通过计算机分析,从六邻体蛋白内筛选出高度保守的抗原表位,将多个抗原表位串联成融合蛋白。利用基因工程技术,构建了高表达抗原表位融合蛋白的工程菌,纯化获得了表达的融合蛋白,并建立了融合蛋白的复性方法。复性的融合蛋白配伍不同的免疫佐剂分别免疫小鼠,检测抗血清免疫效价及相关细胞因子水平,评价其体液免疫和细胞免疫特性,结果,免疫后的小鼠产生了高效价、高特异性的血清抗体,并引起了较强的细胞免疫,显示表达制备的抗原表位融合蛋白可以引起体液免疫和细胞免疫,有希望用于研制通用型腺病毒疫苗。用制备的表位融合蛋白作抗原,研制的腺病毒抗体免疫层析检测试剂,具有很好的检出率和特异性。

新型冠状病毒抗原表位融合蛋白的设计制备及免疫特性研究

新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染人体后可引起发热、咳嗽等呼吸道症状,重症者可发生新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)、严重急性呼吸综合征、甚至死亡。目前针对新型冠状病毒的感染无特效治疗药物,主要依靠疫苗接种来阻断其传播。在新型冠状病毒的结构蛋白中,刺突蛋白(Spike,S)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)是其主要的抗原蛋白,也是制备新型冠状病毒疫苗和研发抗体检测试剂的重要候选蛋白。使用原核表达系统表达重组新型冠状病毒抗原表位融合蛋白,并对其免疫原性进行验证。本研究通过分析筛选出新型冠状病毒结构蛋白S1、N及E蛋白的抗原表位,将筛选出的含强抗原表位的片段串联成融合蛋白,利用基因工程技术构建了表达融合蛋白的工程菌,纯化复性后获得了可溶性的融合蛋白。不同剂量的融合蛋白配伍不同的佐剂后进行小鼠免疫实验,通过检测抗血清的效价及相关细胞因子的水平,评价融合蛋白诱导的体液免疫和细胞免疫效果。设计的融合蛋白以包涵体的形式表达,经透析复性后得到可溶性的融合蛋白;小鼠免疫后产生了高效价的特异性抗体,并引起了较强的细胞免疫;高浓度的融合蛋白产生的免疫效果优于低浓度的融合蛋白;MF59佐剂诱导的免疫效果与铝佐剂无显著差别。本研究为新型冠状病毒融合蛋白的设计拓宽了思路,研制的融合蛋白有望用于新冠病毒重组蛋白疫苗及诊断试剂的研发。

Transcatheter coil embolization of multiple coronary artery-to-left ventricle fistulas： report of a rare case

Coronary artery fistula （CAF） is uncommon but remains the most frequent hemodynamically significant congenital coronary artery anomaly.The majority of fistula is single and drains into the right heart, only 3.5% into the left ventricle.^2 A large fistula requires closure to prevent complications such as myocardial ischemia resulting from coronary steal, congestive heart failure, endocarditis and potential aneurysmal dilatation and rupture.^3-5 Here we presented a rare case of CAF with multiple origins involving left anterior descending artery （LAD）, left circumflex branch （LCX） and right coronary artery （RCA）, and draining into the left ventricle, which was successfully closed by coil embolization.