血清4型禽腺病毒感染LMH细胞后干扰素刺激基因在转录水平表达量的动态变化

【目的】了解鸡肝癌细胞(LMH)感染血清4型禽腺病毒(FAdV-4)后干扰素(IFN)和干扰素刺激基因(ISGs)的表达量变化,为研究FAdV-4与ISGs的相互作用提供参考依据。【方法】试验将FAdV-4感染LMH细胞,观察不同时间点细胞病变,并收集感染0、12、24、36、48、60、72、84和96 h的细胞样品,通过实时荧光定量PCR技术检测感染病毒后不同时间点IFN-α和IFN-β及ISGs基因在转录水平上表达量的动态变化规律。【结果】LMH细胞感染FAdV-448 h时出现典型的细胞病变;在感染12 h后,FAdV-4快速增殖,60 h时达到峰值;感染病毒后各时间点,与对照组相比,IFN-α基因转录水平表达量均显著下调(P<0.05);与对照组相比,在感染后12和24 h,IFN-β基因表达量显著下调(P<0.05),在36 h时迅速上调表达至峰值(P<0.05),在48 h时仍维持在较高水平,之后时间点的表达量有所下降且趋于稳定,但仍显著高于对照组(P<0.05);ISG 12、IFIT 5及DDIT 4基因在感染前期变化不大,在感染后36 h时迅速上调,在感染后96 h达到峰值(P<0.05);ZFP 313、IFITM 3及Viperin基因在感染前期表达量变化不大,随后在36 h迅速上调表达至峰值(P<0.05),在48 h时仍维持在较高水平,之后时间点的表达量有所下降,但仍显著高于对照组(P<0.05);与对照组相比,CD 47、OAS和PKR基因均呈现下调表达。【结论】在FAdV-4感染LMH细胞后,IFN及多种ISGs在转录水平呈现规律性变化,与病毒在LMH细胞中复制存在一定的联系,表明这些天然免疫因子可能在抗FAdV-4反应中发挥着重要作用。

鸡圆圈病毒3型可视化LAMP检测方法的建立及应用

建立鸡圆圈病毒3型(GyV3)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速检测鸡GyV3提供一种诊断方法。参考GyV3的VP3基因序列,设计1套LAMP特异性引物,分别通过温度优化、引物浓度优化和反应时间的优化,确定鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的扩增温度、引物浓度和反应时间,通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测,验证鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性。结果显示,鸡GyV3 LAMP检测方法的反应体系:总体积为20.0μL,包括DNA模板1.0μL,2×Master Mix 10.0μL,内引物GyV3-FIP和GyV3-BIP混合液(工作浓度16.0μmol/L)2.0μL,外引物GyV3-F3和GyV3-B3混合液(工作浓度2.0μmol/L)2.0μL,环引物GyV3-LF和GyV3-LB混合液(工作浓度8.0μmol/L)2.0μL,ddH_(2)O 3μL;鸡GyV3 LAMP检测方法的扩增程序:66℃反应20 min,80℃灭活5 min。鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,最低检测浓度为10^(1)拷贝/μL,组内和组间变异系数小于5%;与常规PCR方法检测临床样品的结果比较,两者结果符合率达100%。建立的鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,具有特异性好、敏感性高及污染小等优点,且检测结果可通过肉眼观察进行判断,适用于GyV3的临床快速筛查。

H9N2亚型禽流感病毒多拷贝M2e蛋白单克隆抗体的制备

为制备H9N2亚型禽流感病毒(AIV)多拷贝M2e蛋白单克隆抗体,试验将纯化的3M2e重组蛋白免疫BALB/c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞株;将获得的杂交瘤细胞株腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水;采用间接ELISA测定腹水效价,鼠源单克隆抗体亚类鉴定试剂盒检测单克隆抗体腹水,三株单克隆抗体重链亚型均为IgG1;Westernblot鉴定单克隆抗体的特异性;使用IFA鉴定3M2e蛋白在Sf9细胞的表达和检测H9N2亚型AIV在MDCK细胞的感染。结果显示:获得了3株分泌多拷贝M2e抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4C7-B11、4E10-A10和5A12-B5;获得腹水的效价均为1∶1000000;三株单克隆抗体重链亚型均为IgG1;Westernblot鉴定三株单克隆抗体均能与2M2e、3M2e和4M2e原核重组蛋白及在Sf9细胞表达的3M2e发生特异性反应;IFA鉴定结果也显示三株单克隆抗体均能检测3M2e蛋白在Sf9细胞的表达,并且能检测到H9N2亚型AIV在MDCK细胞上的感染,出现特异性的绿色荧光;三株单克隆抗体重链亚型均为IgG1。研究获得了H9N2亚型AIV多拷贝M2e单克隆抗体,可用于Westernblot和IFA鉴定,为靶向M2e蛋白H9N2亚型禽流感疫苗的研究提供特异性的检测工具。

mRNA疫苗制备技术在甲型流感病毒疫苗研究中的应用

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、H1N1和H3N2亚型人流感病毒(Influenza virus,IV)均属于甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)。IAV含有多种亚型,毒株变异快,因此IAV疫苗株需要根据当年的优势毒株进行相应的调整,这给疫苗的研制和生产带来巨大挑战。信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)疫苗制备工艺简单、生产时间短且容易规模化生产,在疾病预防方面具有广阔的应用前景。笔者对mRNA疫苗的种类、优化策略和IAV mRNA疫苗的研究现状进行了综述,旨在为IAV mRNA疫苗的研发提供理论参考。

鸡传染性喉气管炎病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立

旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ILTV提供更好的技术支撑。

H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。

二重荧光RT-LAMP鉴别检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体

本研究旨在建立一套通过添加荧光探针FD,反应后可使用成像仪直接观测结果的鉴别检测禽呼肠孤病毒(ARV)和鸡滑液囊支原体(MS)的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据ARV和MS的保守基因片段,设计了2套LAMP引物,并各添加1条FD荧光探针,2条FD探针分别标记CY5和6-FAM荧光基团。结果:ARV阳性对照在成像仪下发出红色荧光,MS阳性对照发出绿色荧光,双重模板经过图像融合后为黄色荧光;特异性结果显示,该二重荧光RT-LAMP检测方法仅能扩增ARV和MS两种病原,对其他常见病原如鸡毒支原体(MG)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)等无扩增反应;敏感性结果显示,该二重荧光RT-LAMP检测方法对ARV和MS的最低检测量分别为1.7×10^(2)copies和1.9×10^(2)copies;使用该方法检测40份临床样品,检出率与本实验室前期建立的二重荧光RT-PCR检测结果相同。综上,该二重荧光RT-LAMP检测方法可特异、敏感地鉴别检测ARV和MS,通过添加FD荧光探针和成像仪观测结果,为不同条件的实验室提供了新的检测手段。

微滴式数字PCR定量检测滑液囊支原体方法的建立及应用

为绝对定量滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),试验根据已发表的MS VlhA基因序列,针对其保守区域分别设计了1对特异引物和1条探针,建立了ddPCR定量检测MS的方法,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示:建立的方法最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为54℃;该方法仅检测出MS毒株,不能检测出其他禽源病原,MS重组质粒标准品最低检测限为3.5拷贝/μL,3个连续稀释的MS重组质粒DNA检测的变异系数均小于5%;45份病鸡喉拭子、肺脏及关节囊样品检测结果显示,该方法的MS阳性检出率(11.1%)高于荧光定量PCR(8.9%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测MS特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量MS提供了适合的技术手段。

禽呼肠孤病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的研发

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)主要感染鸡和火鸡,引起关节炎、腱鞘炎等症状。为满足疾病早期快速诊断的需求,建立一套应用重组聚合酶核酸等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)检测ARV的方法,使用侧向流动免疫试纸条(lateral flow dipstick,LFD)观测结果。首先针对ARV较为保守的片段M1基因设计数套引物,使用普通RT-PCR筛选出一套无非特异条带、敏感性优良的引物组建立ARV RT-RPA-LFD反应体系,优化探针浓度和反应温度,使用建立的反应体系进行特异性和敏感性试验,最后以最低检测模板浓度优化反应时间。结果显示,建立的ARV RT-RPA-LFD反应体系在探针工作浓度为0.12 mmol/L,37℃条件下反应20 min,可最低检测到1.5×10^(1)copies/反应的ARV RNA,并且不与其他常见禽病原体核酸发生反应。使用建立的方法检测40份临床病料,发现有3份ARV阳性,与之前本实验室建立的二重qRT-PCR检测结果一致。结果表明,本研究建立的ARV RT-RPA-LFD检测方法,具有快速、特异,不需要大型复杂仪器,可直观观测结果的优势,为基层兽医实验室和兽医现场检测提供了技术参考。

禽流感病毒H7和N2亚型nano-dPCR检测方法的建立和应用

为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法,从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列,采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物,通过对nano-dPCR反应条件进行优化确定最佳反应体系;利用优化好的反应体系开展nano-dPCR方法的特异性和敏感性试验;采集活禽市场家禽咽喉及泄殖腔拭子样品进行临床样品检测并进行验证。结果表明,成功建立了一种同时检测H7亚型(723 bp)和N2亚型(314 bp)AIV的nano-dPCR方法,该方法特异性良好,其他亚型禽流感病毒及常见禽类呼吸道病毒均未出现特异性的条带,H7亚型AIV和N2亚型AIV的最低核酸检测量分别达到了5×103、5×103拷贝/μL,其敏感性是普通双重PCR检测方法的10倍,其对临床样品检测结果准确率达到100%,可以用于禽流感临床样品鉴别诊断和日常防控监测。

禽呼肠孤病毒微滴数字PCR检测方法的建立

为了建立禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的检测方法,试验根据ARV S1133毒株S1基因序列(GenBank登录号为L39002.1)的保守区设计特异性标准品引物BQ-F/BQ-R,检测引物ARV-F/ARV-R及特异性探针(ARV-Probe);以ARV S1133毒株反转录的cDNA为模板,使用引物BQ-F/BQ-R进行PCR扩增,构建标准品质粒pMD18-T-ARV;以标准品质粒pMD18-T-ARV为模板,使用引物ARV-F/ARV-R及特异性探针进行ddPCR试验,优化引物、探针反应浓度及退火温度,并考察ddPCR检测方法的敏感性、特异性及重复性。结果表明:筛选得到引物和探针的最佳反应浓度分别为1000 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为57.1℃。建立的ARV ddPCR最低能检测到的模板浓度为8 copies/μL;同时检测禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、禽腺病毒(FAdV)及ARV,仅ARV为阳性,其他均为阴性;重复检测试验样品及临床样品3次,变异系数均小于15%。说明ddPCR可用于ARV的临床检测中。

禽源PKR基因生物信息学及组织表达分析

为了探讨禽源双链RNA依赖的蛋白质激酶(PKR)基因的分子生物学特征并了解其在鸡组织/器官中的表达分布情况,试验首先利用生物信息学在线工具对编码蛋白进行了理化性质分析及二级结构、三级结构预测;然后将禽源PKR基因插入至真核表达载体pEF1α-Myc中,将重组真核表达载体pEF1α-Myc-PKR转染至DF1细胞中,通过间接免疫荧光鉴定和Western-blot鉴定对表达的蛋白进行验证,通过激光共聚焦扫描显微镜对其进行亚细胞定位;最后采用实时荧光定量PCR检测该基因在SPF鸡不同组织/器官中的分布情况。结果表明:禽源PKR蛋白的分子式为C2744H4332N772O842S23,共编码550个氨基酸,理论分子质量为62346.63 u,等电点(pI)为8.63,不稳定系数为45.54,属于不稳定蛋白;二级结构中,α-螺旋占比为33.27%,延伸链占比为13.64%,β-转角占比为4.73%,无规则卷曲占比为48.36%;三级结构预测模型与人类PKR蛋白的相似性为47.29%。经双酶切验证成功构建了重组真核表达载体pEF1α-Myc-PKR,该载体可在DF1细胞中表达PKR蛋白,蛋白质分子量约为62 ku,具有良好的反应原性,且主要定位于细胞质中。禽源PKR基因在SPF鸡的17个受检组织/器官中均有表达,但在不同组织/器官中的表达量不同;在血液中的表达量最高,然后依次为胰腺、肠、肺脏、脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、腺胃、肌胃、皮肤、气管、脑和肾脏;在关节和肌肉中的表达量极低。说明PKR基因可能参与血液免疫反应,在先天免疫反应中扮演重要角色。

2018年广西活禽市场新城疫病毒分子流行病学分析

为跟踪调查广西活禽市场新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的流行分布和分子演化特征,2018年在广西不同城市10个活禽市场随机采集鸡、鸭、鹅和鸽子泄殖腔和咽喉拭子样品2820份,通过病毒分离与F基因扩增和测序,分析其遗传进化特征。结果显示:从4种宿主中共分离得到54份NDV,包含CLASSⅠ基因1b亚型、CLASSⅡ基因Ⅰ型和CLASSⅡ基因Ⅻ型三种基因型,且发现同一宿主存在不同基因型混合感染的情况。CLASSⅠ基因1b亚型NDV占比最大(50/54,92.5%)。遗传进化分析显示,广西分离株与同基因型参考株处于不同的小分支,存在地域差异。

禽呼肠孤病毒感染DF1细胞后干扰素刺激基因在转录水平表达量的动态变化

为了解干扰素(interferon,IFN)和干扰素刺激基因在禽呼肠孤病毒(ARV)感染DF1细胞后的表达情况,试验将ARV病毒感染DF1细胞,观察细胞病变,收集感染后0、6、12、24、36、48、72、96 h的细胞样品,抽提反转录成cDNA,通过实时荧光定量PCR技术检测干扰素IFN-α和IFN-β及9种禽源常见干扰素刺激基因在感染后不同时间点在转录水平表达量的动态变化规律。结果显示,在ARV感染DF1细胞后,DF1细胞出现典型的细胞病变,感染后12 h病毒开始快速增殖,在36~96 h维持在较高的水平;IFN-α和IFN-β在转录水平的表达量在感染后均表现为显著下调(P<0.05;P<0.01);IFI6、OAS、IFIT5、ISG12在转录水平表达量变化规律相似,均呈现显著上调表达(P<0.05;P<0.01),在感染后96 h达到峰值;其中IFIT5的上调幅度最大,感染后96 h的表达量是0 h的19.62倍(P<0.01);而Mx、IFITM3、PKR、Viperin、ZAP的表达量变化规律相似,均表现为显著下调表达(P<0.05;P<0.01),其中Mx、IFITM3、Viperin的下调幅度较大,PKR和ZAP下调幅度很小。说明在ARV感染DF1细胞后,干扰素及多种干扰素刺激基因在转录水平呈现规律性变化,与病毒在DF1细胞中复制存在一定的联系。结果表明,ARV感染后可以诱导多种干扰素刺激基因的表达,这些干扰素刺激基因在抵御ARV病毒的入侵,抑制ARV的复制、释放及病毒的清除中发挥着重要作用。本研究为今后深入研究ARV的致病机理和宿主的抗病毒免疫应答提供了参考。

水牛γ干扰素的原核表达及其抗病毒活性

为了获得具有抗病毒活性的水牛γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)蛋白,试验采用PCR方法扩增水牛IFN-γ基因编码区序列,将其与pET-32a载体连接,构建重组表达质粒pET32a-IFN-γ,并将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,用IPTG诱导表达目的蛋白,对表达的重组蛋白进行SDS-PAGE分析、纯化、Western-blot鉴定与质谱分析,以及抗病毒活性检测。结果表明:水牛IFN-γ基因编码区序列PCR扩增产物大小约为520 bp;重组表达质粒pET32a-IFN-γ的双酶切和测序鉴定结果均正确;阳性菌株经诱导后表达的重组蛋白大小约为39 ku,主要以可溶性蛋白形式表达,且能与His标记小鼠源单克隆抗体发生特异性反应,其肽段氨基酸序列与目的蛋白氨基酸序列完全匹配;纯化后的重组蛋白IFN-γ能够有效抑制牛病毒性腹泻病毒引起的细胞病变,抗病毒活性约为294.1 U/mg。说明水牛IFN-γ蛋白在大肠杆菌中成功表达,并具有一定抗病毒活性。

水牛α1、α2、α3干扰素基因的克隆、分析及表达

为了给体外研究水牛α1、α2、α3干扰素(interferon, IFN)的抗病毒作用提供试验材料,试验采用PCR技术克隆水牛IFN-α1、IFN-α2、IFN-α3编码区序列(CDS),分别采用DNAMAN、 MEGA7.0软件进行抗原肽段的预测、进化树的绘制,构建原核表达载体pET-32a-IFN-α1、pET-32a-IFN-α2、pET-32a-IFN-α3,将以上载体转入至BL21(DE3)感受态细胞中,用1.0 mmol/L IPTG分别在37,25℃下对重组菌诱导6 h,通过SDS-PAGE、Western-blot分析外源基因在大肠杆菌的表达情况。结果表明:水牛IFN-α1、IFN-α2、IFN-α3编码区序列全长分别为570,588,555 bp,分别编码189,195,184个氨基酸。水牛IFN-α1、IFN-α3与山羊IFN-α、牛IFN-αclassⅠ亲缘关系较近,与鸡IFN-α、爪蟾Ⅰ型IFN亲缘关系较远;水牛IFN-α2与牛IFN-αⅡ最近。在37℃下诱导表达,水牛IFN-α1、IFN-α2、IFN-α3重组蛋白主要以不可溶性蛋白形式存在;当其他条件不变,把诱导温度降到25℃时,重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在,经Western-blot鉴定为目的蛋白。说明水牛IFN-α1、IFN-α2、IFN-α3蛋白在BL21(DE3)大肠杆菌中表达成功。

血清4型禽腺病毒广西分离株GX2019-010全基因组测序与分析

为了解广西地区血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的基因特征,本研究对实验室前期分离的一株FAdV-4(命名为GX2019-010)进行了全基因组测序,对所获核苷酸序列进行同源性比对和遗传进化分析,并进一步分析了主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列。结果显示,GX2019-010全长43719 bp,GC含量为54.9%,主要包括43个潜在蛋白质编码区域。核苷酸序列同源性比对发现,GX2019-010与致病株MX-SHP95的同源性为95.8%,与非致病株ON1和KR5同源性分别为95.0%和95.2%。遗传进化分析显示,GX2019-010与中国FAdV-4近几年的流行毒株在同一分支,而与国外FAdV-4毒株不在同一分支,说明FAdV-4存在遗传差异,主要的差异存在于基因组的右端,国内分离株均出现1966 bp的缺失,其中包括ORF19、ORF48和ORF27基因的缺失,说明中国流行的FAdV-4具有地域性。对主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列分析发现,3个主要结构蛋白均有氨基酸位点的突变,其中Fiber-2的突变位点最多。本研究丰富了广西地区FAdV-4的基因库,为今后心包积液-肝炎综合征(HHS)的防控及流行病学调查研究提供了参考依据。

南方不同季节育雏鸡舍主要环境因子的变化研究

试验以有窗封闭式笼养育雏鸡舍为对象,于2018年3月~2019年1月开展研究鸡舍内环境的温度、相对湿度、二氧化碳(CO2)、氨气(NH3)、硫化氢(H2S)、二氧化硫(SO2)浓度和细菌总数,并分析环境因子之间的关系。结果显示:不同季节育雏舍内环境温度满足鸡群正常需要,鸡群成活率超过97%。夏季舍内相对湿度达82.48%,并且料肉比高于春季、秋季和冬季。春季、秋季和冬季CO2浓度易超标,不同季节舍内白天温度均高于夜晚,而白天CO2浓度低于夜晚。不同季节舍内环境温度分别与相对湿度、CO2浓度呈负相关和正相关关系。试验表明:有窗封闭式育雏鸡舍内不同季节雏鸡生长发育良好,但夏季湿度过高,春季、秋季和冬季舍内CO2浓度高于标准。建议夏季应合理控制舍内相对湿度,春秋冬季注意平衡舍内的保暖和通风工作。

广西密闭笼养舍内环境参数与花鸡生产性能相关性分析

为了解广西密闭笼养舍内环境参数变化与花鸡生产性能的相关性,以广西密闭笼养花鸡为对象,从2017年11月至2018年11月,在鸡舍内的前、中、后位置中间设立监测位点,每天测定收集笼养鸡舍内环境参数包括温度、相对湿度、CO2、NH3、H2S、SO2浓度;每隔3天,在鸡舍内前、中、后位置分5点测定鸡舍内细菌数,同时记录花鸡产蛋率等生产性能。结果显示,周年内,鸡舍内平均温度和相对湿度,5~9月份比其它月份高,其中8月份平均温度最高达29.2℃,7月份平均相对湿度最高为85.12%。周年内,冬季鸡舍内CO2、NH3浓度最高,分别为343.64 mg/m3和2.98 mg/m3,夏季最低,分别为254.04 mg/m3和0.78 mg/m3,全年鸡舍内H2S浓度低,没有检出SO2浓度。鸡舍内细菌总数冬季最高,达7.87×104cfu/m3,全年细菌检出总数高于2.5×104cfu/m3的农业行业推荐标准。周年内花鸡年平均产蛋率为60.28%,春季产蛋率最高为73.41%,冬季最低为45.55%。相关性分析结果显示,鸡舍内温度、相对湿度、CO2和NH3浓度与鸡舍内空气中细菌总数不相关(P>0.05),温度、相对湿度与CO2、NH3、H2S呈负相关关系(P<0.01或P<0.05),温度与鸡群产蛋率呈显著的负相关关系(P<0.01),即密闭笼养舍内温度对花鸡的产蛋率有显著影响。

禽呼肠孤病毒σB和σC蛋白在昆虫细胞中的共表达

本研究旨在获得具有天然构象和活性良好的禽呼肠孤病毒(ARV)σB和σC蛋白,采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中共表达σB和σC蛋白,并对其活性进行鉴定。根据NCBI数据库中ARVσB和σC基因序列设计引物,将两个基因克隆至pFast-Dual载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭杆粒。通过转染sf9细胞,筛选到含有σB和σC基因的重组病毒。将重组病毒感染sf9细胞,通过优化接毒量和收获时间等参数,确定最佳表达条件,在sf9细胞中高效共表达σB和σC蛋白。Western blotting和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,成功在sf9细胞中共表达了ARVσB和σC蛋白,并具有很好的生物学活性。本试验结果为开发鉴别诊断试剂以及ARV颗粒疫苗的研究奠定了基础。