猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白亲和肽的原核表达及其病毒亲和性分析

为了研究猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白(M蛋白)亲和肽的病毒亲和性,建立快速有效的TGEV检测方法,设计了1条含有TGEV M蛋白亲和肽的串联基因,核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工基因合成获得了含有M蛋白亲和肽基因的重组质粒pUC57-MQHT。然后,根据合成基因的序列,设计合成了1条特异性引物,以pUC57-MQHT为模板,通过PCR获得了150 bp的TGEV M蛋白亲和肽基因。亲和肽基因通过Bam HⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1,获得重组质粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT。重组质粒经Bam HⅠ单酶切和Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT,分子质量分别为25,31 ku。切胶纯化后,重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT分别经His标签单克隆抗体和GST标签单克隆抗体鉴定,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。Western Blot分析表明,2种重组蛋白可与TGEV特异性结合。Dot-ELISA分析表明,在TGEV滴度为1×10 3,5×10 2,2.5×10 2 TCID50/mL时2种重组蛋白都可显示出阳性反应,而在1.25×10 2 TCID50/mL滴度时无可见斑点,具有良好的TGEV亲和性。阻断试验表明,1∶100或1∶200稀释的TGEV阳性血清可完全阻断TGEV H株(1×10 5 TCID50/mL)与2种重组蛋白的结合,特异性良好。为建立TGEV诊断方法奠定了一定的理论和物质基础。

一株溶磷真菌的鉴定及其促生特性研究

【目的】从小麦田土壤中分离筛选出一株具有溶磷及促生特性的真菌菌株,为微生物肥料的开发与利用提供种质资源。【方法】本试验利用无机磷培养基从小麦田土壤中筛选得到一株具有较强溶磷能力的真菌菌株R3,通过形态学特征和ITS序列分析,对菌株进行分类学鉴定;采用液体培养测定菌株对Ca_(3)(PO_(4))_(2)、 AlPO_(4)和FePO_(4)等3种不同磷源的溶解能力;并通过盆栽试验测定其对小麦的促生效应。【结果】经鉴定菌株R3归属于产红青霉(Penicillium rubens)。菌株R3在无机磷培养基上的溶磷圈直径D平均值为27.99 mm,菌落直径d平均值为19.26 mm, D/d为1.45。菌株R3对Ca_(3)(PO_(4))_(2)和AlPO_(4)的溶解能力在第4天时最高,分别为328.79 mg·L^(-1)和95.99 mg·L^(-1);对FePO_(4)的溶解量在第5天时达到最高值,为75.39 mg·L^(-1)。菌株R3对不同磷源培养基pH的影响总体呈先下降后平稳的趋势。盆栽试验结果表明,与未接菌的对照组相比,接种R3菌液后小麦在株高、根长、鲜重和叶绿素含量方面分别提高了18.23%-35.65%、27.63%-50.44%、37.99%-50.94%和9.59%-19.57%。【结论】溶磷真菌R3对小麦生长有显著促进作用,可为进一步构建促生菌菌群提供良好的种质资源。

番鸭细小病毒非结构蛋白NS1与水禽真核翻译延伸因子1A1的体外互作分析

旨在探讨番鸭细小病毒(MDPV)非结构蛋白NS1与水禽真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)之间的互作关系。根据GenBank中已发表的北京鸭和浙东白鹅eEF1A1基因序列,经大肠杆菌偏爱密码子优化,人工合成的质粒分别命名为pUC57-DeEF1A1和pUC57-GeEF1A1;对含有MDPV YL08株NS1基因的重组质粒pUC57-NS1、pUC57-DeEF1A1和pUC57-GeEF1A1进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收目的片段后分别插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a中,构建了重组质粒pGEX-DeEF1A1、pET-GeEF1A1、pET-NS1和pGEX-NS1;重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白GST-DeEF1A1、TRX-GeEF1A1、TRX-NS1和GST-NS1的表达;采用HRP标记的GST单克隆抗体鉴定GST-DeEF1A1、HRP标记的His单克隆抗体鉴定TRX-GeEF1A1;采用HRP标记的His单克隆抗体鉴定TRX-NS1、HRP标记的GST单克隆抗体鉴定GST-NS1,采用MDPV感染番鸭血清鉴定TRX-NS1和GST-NS1的抗原性;采用GST pull-down试验验证GST-DeEF1A1与TRX-NS1、GST-NS1与TRX-GeEF1A1的互作。结果表明,获得的重组蛋白GST-DeEF1A1、TRX-GeEF1A1、TRX-NS1和GST-NS1的分子量分别为76.9,67.9,89.5,98.6 ku;GST-DeEF1A1和GST-NS1可与HRP标记的GST单克隆抗体特异性结合,TRX-GeEF1A1和TRX-NS1可与HRP标记的His单克隆抗体特异性结合;GST-NS1和TRX-NS1可与MDPV感染番鸭血清特异性结合,抗原性良好;GST pull-down试验中,GST-DeEF1A1可与TRX-NS1互作,GST-NS1不与TRX-GeEF1A1互作。本研究表明,MDPV NS1蛋白可以和北京鸭eEF1A1在体外相互作用而不能和浙东白鹅eEF1A1在体外相互作用,互作结果差异性可能与二者的102-106 aa,108 aa的氨基酸残基有关。

猪传染性胃肠炎病毒spike蛋白亲和肽的原核表达

【目的】原核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)spike蛋白亲和肽(SQHT),检测其病毒亲和性,为建立TGEV诊断方法奠定理论和物质基础。【方法】人工合成TGEV spike蛋白亲和肽基因,亚克隆后将该基因分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1中,构建重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,对重组质粒进行BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。将重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG进行诱导表达,对其表达产物的生物学活性进行检测。【结果】亚克隆获得了150 bp的TGEV spike蛋白亲和肽基因。成功构建了重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,并诱导表达出重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT,其分子质量分别为25和31 ku。Western blot分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子具有良好的亲和性;Dot-ELISA分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子的最低结合滴度TCID50为5×102 mL-1。特异性试验表明,重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT均可与TGEV产生特异性结合,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PoRV)结合。【结论】使用原核细胞成功表达了TGEV spike蛋白亲和肽,表达的重组蛋白具有很好的TGEV特异亲和性。

抗鹅细小病毒NS1蛋白单克隆抗体可变区的原核表达

为了在大肠杆菌中表达抗鹅细小病毒(GPV)NS1蛋白单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,并测定其与NS1蛋白结合活性。对抗GPV NS1蛋白单克隆抗体VL、VH基因核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工合成获得了含有可变区基因的重组质粒pUC57-VL和pUC57-VH。然后用Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切pUC57-VL、pUC57-VH,回收340 bp的VL基因和370 bp的VH基因。目的基因通过Bam HⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a,获得重组质粒pET-VL和pET-VH。重组质粒经Bam HⅠ单酶切和Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-VL和TRX-VH的表达,分子量分别为30.3,31.4 ku。纯化后的重组蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性结合,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。间接ELISA分析表明,0.4μg的TRX-VH可与25 ng的GST-NS1蛋白特异性结合而0.4μg的TRX-VL不能与各包被量的GST-NS1蛋白特异性结合,TRX-VH与GST-NS1蛋白的特异性结合可被1∶200稀释的GPV感染鹅血清完全阻断。

我国林产工业实现碳中和的基本策略

林产工业作为具有可持续发展潜力的绿色产业,具备通过市场化交易机制实现政府提出的“双碳”发展战略目标的潜力。文中在分析森林碳汇在碳中和愿景实现过程中所起作用的基础上,探讨林产工业在“双碳”战略中的定位,阐述未来我国林产工业实现碳中和的主要策略,以期为开展中国林产工业碳中和试点提供借鉴。

基于碳中和愿景的绿地碳汇价值实现过程研究

中国“双碳”战略的提出为生态服务型产品价值的实现提供了良好的发展机遇。绿地碳汇以其特殊的固碳属性在碳中和愿景实现的过程中发挥着不可替代的作用。通过绿地碳汇的研究成果进行技术分类对比,对基于碳中和愿景的绿地碳汇价值实现的技术路径和计量监测方法进行了技术探讨,针对绿地碳汇价值实现过程中存在的技术问题,提出了选择合适的碳汇技术评价体系、完善碳汇核算的技术规则以及重视碳汇基线调查三项技术建议,以期对基于碳中和愿景的绿地碳汇生态服务价值实现提供参考。

细胞自噬与细小病毒感染相互作用的研究进展

细胞自噬是生物体内一个保守的生物学过程,通过溶酶体对外源微生物、胞内长寿蛋白以及衰老细胞器的吞噬和降解实现能量再循环.当细胞被外源性病原微生物(如病毒)刺激时,往往会触发自噬的激活或抑制.由于自噬具有抗病毒作用,因此许多病毒可能通过编码一些蛋白逃逸并抵抗该过程,同时病毒还可以利用自噬增强其自身复制或增加潜伏感染的持续性.关于病毒与细胞自噬的相互作用是十分复杂的.主要综述已发表的细小病毒与细胞自噬相互作用的研究进展,简要概述了自噬和细小病毒,并回顾了人类和动物细小病毒与自噬之间的已知相互作用,及自噬在细小病毒DNA复制中的作用和机制.

产黄酮马齿苋内生真菌的筛选及代谢产物抑菌效果初步研究

从马齿苋植株中分离内生真菌,提取其代谢产物,以黄酮类化合物显色反应和紫外光谱特征对内生真菌代谢产物进行初步鉴定,筛选得到产黄酮内生真菌AG-10,使用ITS1、ITS4通用引物,扩增菌株AG-10的18S rDNA序列,结合菌落和分生孢子形态特征,对菌株AG-10进行分类鉴定,并采用滤纸片法研究AG-10的代谢产物抑菌效果;菌株AG-10鉴定结果为镰刀菌(Fusarium sp.),其代谢产物可抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,最小抑菌质量浓度分别为1.0 mg/mL和2.0 mg/mL。研究结果证实了马齿苋中存在有可能产黄酮类化合物的内生真菌,为利用微生物产黄酮类化合物提供参考。

Neorhizobium petrolearium OS53联合紫花苜蓿协同修复石油污染土壤研究

【目的】探究Neorhizobium petrolearium OS53与紫花苜蓿协同修复石油污染土壤的机制。【方法】使用Illumina和Nanopore平台对菌株OS53进行全基因组测序,构建菌株基因组完成图,并进行基因预测及功能注释,分析其中与结瘤促生及石油降解相关基因,并通过实验测定菌株OS53产吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)、铁载体、溶磷和解钾等与促生相关的能力。使用试剂盒对联合修复前后土壤中土壤脲酶、脱氢酶、多酚氧化酶和脂肪酶活性及紫花苜蓿的叶绿素、丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖和超氧化物歧化酶等生理指标进行测定。【结果】菌株OS53的基因组由一个5.56 Mb的环形染色体和2个大小分别为0.92 Mb和0.38 Mb的质粒组成,基因组G+C含量为60.2%,共编码6968个基因。菌株OS53与N.petrolearium DSM 26482^(T)的16S rRNA基因序列相似性最高,为99.86%,且在系统发育树上形成稳定分支,表明菌株OS53与N.petrolearium为同一种,因此将OS53命名为N.petrolearium OS53。试验结果表明,菌株OS53具有产IAA能力,并在其基因组中也发现相关基因。在初始石油含量为(4403.30±222.10)mg/kg时,经过120d修复,OS53与紫花苜蓿协同修复效率能够达到57.53%,比不接种OS53、仅接种OS53和仅种植苜蓿分别提高了44.26%、41.69%和8.84%。在联合修复体系中,紫花苜蓿叶绿素、可溶性蛋白和可溶性糖的含量有所提高,丙二醛和脯氨酸的含量以及超氧化物歧化酶的活性有所降低,同时土壤中多酚氧化酶、脱氢酶、脂肪酶和脲酶的活性都有所提高。【结论】菌株OS53具有产IAA的能力,并且能够促进紫花苜蓿在石油污染土壤中的生长,进而提高土壤中与石油降解相关部分酶活,最终提高联合修复体系对石油污染土壤的修复效果。

承压含水层完整井降水回灌水量计算方法研究

基于承压含水层降水回灌水位线方程,推导得出降水回灌相互耦合作用下,承压含水层水量理论求解公式。并通过数值分析与公式计算对比,分析了公式精度和适用范围,验证了公式的可靠性。给出了承压含水层一体化降水回灌设计方法和计算步骤。

协同创新视域下地方高校研究生导师队伍建设

随着高等教育的不断发展,校所协同的学术型研究生培养模式逐渐成为高校研究生教育改革的热点。该文介绍了协同创新的概念及其理论基础,通过分析地方高校研究生导师队伍建设的现状与存在的问题,提出协同创新视域下地方高校研究生导师队伍建设的内涵、特点、建设路径,以期为地方高校研究生导师队伍建设提供可行的思路。

鸡细小病毒研究进展

鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)发现于20世纪80年代早期,普遍存在于患有发育障碍与矮小综合征(Runting stunting syndrome,RSS)病鸡的肠道内。RSS以腹泻、精神沉郁、体温调节障碍、生长迟缓、饲料消耗增加为主要特征,给养鸡业造成较大的经济损失。用于ChPV检测的方法包括PCR、real-time PCR、ELISA、高通量测序技术等,目前还没有可用于防治ChPV的特效疫苗和药物。文章综述了目前关于ChPV在分子生物学、流行病学、发病机制和诊断方法方面的最新研究进展,以期为我国ChPV相关方面的研究提供借鉴。

中国林业碳汇项目额外性论证实践

林业碳汇项目凭借其兼具多重生态与经济效益逐渐受到国内外的关注。国际上认为林业碳汇项目所带来的环境效益是额外的,在该项目活动未发生时是不可能产生的。额外性是项目开发的基础,在项目开发前必须对其进行额外性论证。但目前国内许多项目业主开发时忽略了对项目额外性的考虑,因而造成大量林业碳汇项目无法获得审批。文中对额外性问题进行分析并以大兴安岭十八站林业碳汇项目为案例进行说明,以期为业主在开发林业碳汇项目时进行额外性论证提供帮助。

水禽核糖体蛋白S12与番鸭细小病毒结构蛋白VP1的体外相互作用研究

为了探讨水禽核糖体蛋白S12(ribosomal protein S12,RPS12)与番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)结构蛋白VP1之间的相互作用关系,试验根据GenBank中已登录的北京鸭和浙东白鹅RPS12基因序列,人工合成重组质粒pUC57-DRPS12和pUC57-GRPS12,双酶切后回收目的片段,分别插到载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒pGEX-DRPS12和pGEX-GRPS12。将pGEX-DRPS12、pGEX-GRPS12及含MDPV YL08株VP1基因的重组质粒pET-VP1分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达,利用HRP标记的GST或His标签单克隆抗体,通过Western-blot法鉴定重组蛋白,采用GST pull-down法体外检测水禽RPS12蛋白与VP1蛋白的相互作用情况。结果表明:获得的重组蛋白GST-DRPS12、GST-GRPS12和TRX-VP1分子质量分别为41.2,40.3,98.8 ku,浓度为1.32,1.29,0.81 mg/mL;重组蛋白TRX-VP1能够与MDPV YL08株感染的番鸭血清特异性结合,具有较好的反应原性;重组蛋白TRX-VP1可以和GST-DRPS12、GST-GRPS12在体外相互作用。说明MDPV VP1蛋白与水禽RPS12蛋白存在相互作用关系。

脊椎动物细小病毒衣壳结构研究进展

脊椎动物细小病毒是一类感染脊椎动物的单链DNA病毒,该病毒衣壳无包膜,呈T=1二十面体对称。从1991年第1个脊椎动物细小病毒--犬细小病毒衣壳结构发布至今,研究人员陆续解析了近100种该类病毒衣壳结构,并揭示了其结构与功能的关联性。尽管脊椎动物细小病毒衣壳蛋白序列多样性高,然而其衣壳的拓扑学结构相对保守。脊椎动物细小病毒衣壳核心蛋白二级结构之间的环状结构构象各不相同,从而使衣壳表面形态具有种属特异性。这些变化使每种病毒可与特定宿主受体结合而产生特定组织嗜性和抗原多样性。文章综述了脊椎动物细小病毒衣壳结构功能和基于衣壳结构的基因工程载体开发的研究进展,以期为我国脊椎动物细小病毒衣壳结构方面的研究提供借鉴。

石油污染对土壤微生物群落影响及石油降解菌的筛选鉴定

为研究石油污染对土壤中细菌群落结构及土壤理化性质的影响,分离筛选石油降解菌,从陕北宝塔、吴起、靖边和延长4个县区采集石油污染土壤和未受石油污染土壤,测量土壤中石油、有机质、硝态氮、铵态氮、速效磷、速效钾的含量以及pH;采用高通量测序技术对2种土壤中细菌群落结构进行比较分析;并以石油为唯一碳源,从石油污染土壤中筛选高效石油降解菌,并对所筛选的高效石油降解菌进行16S rDNA鉴定。陕北4个县区石油污染土壤中铵态氮、硝态氮、速效磷和速效钾含量分别降低了0.57,6.63,4.34,8.91 mg/kg,有机质含量增加了2~21倍。石油污染土壤中细菌群落的丰富度和多样性均降低,其中变形菌门(Proteobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)为主要菌门,分枝杆菌属(Mycobacterium)为丰度最高菌属。以石油为唯一碳源,分离得到8株石油降解菌,其中菌株OS33和菌株OS62-1在5 d内的石油降解率分别为80.51%和81.60%,经鉴定OS33为迪茨氏菌(Dietzia sp.),OS62-1为红球菌(Rhodococcus sp.)。石油污染发生后,土壤中细菌群落的丰富度和多样性降低,筛选的8株石油降解菌中OS62-1石油降解率最高,研究结果进一步丰富了陕北地区石油降解菌菌种资源库。

白刺花根瘤菌与非根瘤菌在不同培养条件下互作模式的转变

【目的】除根瘤菌外,豆科植物根瘤中还存在着大量的非根瘤菌,它们存在的意义及其潜在的生态学功能还不清楚,尤其是它们与根瘤菌间的互作机制更需揭示。【方法】以从陕北旱区野生白刺花根瘤中分离得到的根瘤菌和非根瘤菌为研究对象,采用共培养、二分隔平板实验和单独培养的方法,于正常培养条件下从白刺花根瘤中筛选出有互作效应的菌株,测定其对p H和Na Cl的耐受性以及对各种氮源的利用情况,并通过根瘤菌的菌落直径、生长曲线和多糖产量来表征其互作效应,进一步探明互作菌株在盐碱和营养胁迫条件下互作效应转变的机制。【结果】在盐碱胁迫下,非根瘤菌Pseudomonas oryzihabitans BT-147和Priestia aryabhattai BT-59对Rhizobium azibense BT-170互作效果由正常培养条件下的抑制转变为促生,与对照组相比试验组R.azibense BT-170菌落直径分别增加了0.803 mm和1.034 mm。Bacillus siamensis BT-9-1在正常培养条件下抑制Mesorhizobium metallidurans YC-39的生长,而在盐碱胁迫下表现为促生作用,与对照组相比试验组M.metallidurans YC-39菌落直径增加了1.019 mm,多糖产量由1.088μg/m L增加到2.555μg/m L。在以谷氨酸作为唯一氮源时,Pseudomonas oryzihabitans BT-147和Priestia aryabhattai BT-59对R.azibense BT-170的互作效果转变为促生作用,R.azibense BT-170试验组与对照组菌落直径差分别达到1.348 mm和2.196 mm,其多糖产量从对照组的0.559μg/m L分别增加到0.821μg/m L和3.341μg/m L。【结论】在盐碱和氮源的胁迫下,非根瘤菌Pseudomonas oryzihabitans BT-147和Priestia aryabhattai BT-59对R.azibense BT-170互作效果由正常培养条件下的抑制转变为促生,并显著提高了R.azibense BT-170多糖的产量(P<0.05),不同培养条件下根瘤菌与非根瘤菌互作模式的转变,提高了根瘤菌的抗逆性,扩大了根瘤菌可利用氮源的范围,揭示了非根瘤菌在根瘤微生态中所发挥的作用,并从体外简化了根瘤微生态中复杂的相互作用。

A Study of International Forest Financing Mechanism Development

The paper analyzed the bottlenecks of international forest financing development from the perspective of the development state of forest financing mechanism.It also analyzed the development possibilities of emerging financing channels while introducing official development assistance and non-financial development assistance in the framework of international forest financing mechanism,and pooled the various existing forest-involved funds to propose a feasible architecture direction for possible future development.