艳山姜叶的化学成分研究

目的:研究艳山姜叶的化学成分。方法:采用硅胶柱色谱、MCI、Sephadex LH-20凝胶色谱及聚酰胺柱色谱对艳山姜叶的95%提取物进行分离纯化,运用NMR、MS及文献对照对所得到的化合物进行结构鉴定。结果:从艳山姜叶中分离得到10个化合物,分别鉴定为:二氢-5,6-去氢醉椒素(1)、紫云英苷(2)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)、1,2-di-O-octanoly-3-O-(6-O-α-D-galactopyranosyl-β-D-galactopyranosyl)-sn-glycerol(4)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(5)、4′,6′-二羟基-2′-甲氧基二氢查尔酮(6)、小豆蔻明(7)、anibadimer A(8)、1-p-menthene-3,6-diol(9)、β-谷甾醇(10)。结论:其中,化合物3～5、8和9为首次从该植物中分离得到。

铁皮石斛多糖酶解法提取工艺优化及抗氧化活性研究

目的:通过正交实验探究铁皮石斛多糖5种酶解法的最优提取工艺,并比较不同酶解法对铁皮石斛多糖相对分子质量、黏度以及抗氧化活性的影响。方法:以铁皮石斛为原料,用纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶分别进行酶解条件的正交实验,对照传统水提法,对不同提取工艺下多糖的得率、相对分子质量、黏度、体外抗氧化能力进行比较和研究。结果:得到5种酶解法的最优提取工艺;不同提取方法按照多糖得率由高到低依次为:葡聚糖酶(55.41%)>果胶酶(53.12%)>纤维素酶(51.93%)>甘露聚糖酶(48.42%)>淀粉酶(46.90%)>水提多糖(38.76%);相比较于传统热水提取法,经酶解后提取所得多糖的相对分子质量和黏度均显著降低,其中淀粉酶降低相对分子质量作用稍弱;不同提取方法的多糖呈现不同的抗氧化能力,以果胶酶酶解的多糖抗氧化活性最强,总体优于传统水提法所得多糖。结论:酶解法显著提高多糖的提取率,所得多糖相对分子质量、黏度等物化性质显著降低且以果胶酶提取多糖的抗氧化活性最显著。不同酶解法对铁皮石斛多糖结构和连接方式的影响有待进一步探索。

基于TXNIP信号通路调控的艳山姜挥发油对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用

目的:研究艳山姜挥发油(EOAZF)对高浓度葡萄糖(HG)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的保护作用,为研究EOAZF改善糖尿病诱导的心血管疾病提供实验依据。方法:该项目研究分为正常组,模型组(25 mmol·L^(-1)葡萄糖组),阳性药组(100 mg·L^(-1)维生素C),EOAZF低、中、高浓度组(0.25,1,4μg·L^(-1))。通过建立HG诱导HUVECs损伤模型,检测不同给药组内皮细胞中的丙二醛(MDA),一氧化氮(NO)和内皮素1(ET-1)的分泌量,评价EOAZF对高糖诱导HUVECs损伤的保护作用;采用AnnexinV-FITC/PI双染实验以及DCFH-DA荧光探针标记,考察EOAZF对HG诱导HUVECs的凋亡水平和活性氧(ROS)产生的影响;采用蛋白免疫印迹法(Western blot),实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),检测硫氧还原蛋白相互结合蛋白(TXNIP)与硫氧还原蛋白(Trx-1)蛋白表达和转录水平,采用胰岛素二硫键还原法测定细胞内总Trx-1的酶活性。结果:细胞形态学结果显示,与正常组比较,模型组HUVECs增殖速度明显降低,细胞形态受损;与模型组比较,0.25,1,4μg·L^(-1)EOAZF对HG诱导损伤的HUVECs具有保护作用,且呈浓度依赖性;与正常组比较,模型组显著上调HUVECs内MDA和ET-1分泌量(P<0.05),下调NO的分泌(P<0.01);与模型组比较,不同浓度EOAZF均能改善HG诱导的MDA,ET-1和NO的分泌,其中4μg·L^(-1)EOAZF能明显降低HG诱导的HUVECs细胞MDA和ET-1的分泌量(P<0.05),明显上调HUVECs细胞NO的分泌量(P<0.05);细胞凋亡和ROS检测结果显示,与正常组比较,模型组细胞凋亡和ROS水平均显著上调(P<0.01);与模型组比较,4μg·L^(-1)EOAZF明显降低HG诱导的HUVECs中ROS水平和细胞凋亡率(P<0.05);免疫印迹实验结果和Trx-1活性检测结果显示,与正常组比较,造模组细胞中TXNIP的mRNA和蛋白水平显著上调(P<0.01),Trx-1的活性显著降低(P<0.01);与模型组比较,4μg·L^(-1)EOAZF明显下调HG诱导的TXNIP的mRNA与蛋白的表达上调(P<0.05),同时增强细胞内总Trx-1的酶活活性(P<0.05),发挥抗氧化应激的作用。结论:EOAZF能改善HG诱导损伤的HUVECs的内皮功能,降低细胞内ROS水平和凋亡水平,发挥显著的内皮细胞保护作用,其机制可能是通过降低TXNIP的mRNA和蛋白水平以及增强Trx-1的活性而发挥的抗氧化应激作用。

基于Notch/Snail信号的艳山姜挥发油对内皮间质转分化的保护作用研究

目的:探讨艳山姜挥发油对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的内皮间质转分化(EndMT)的干预作用及信号机制。方法:以10 ng·mL^-1 TGF-β1诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立EndMT模型。实验共分为两个部分:(1)分组:正常组,模型组(10 ng·mL^-1 TGF-β1),EOFAZ低剂量组(10 ng·mL^-1 TGF-β1+1μg·L^-1 EOFAZ),EOFAZ高剂量组(10 ng·mL^-1 TGF-β1+4μg·L^-1 EOFAZ)。EOFAZ干预作用2 h后加入TGF-β1共同孵育72 h。采用Transwell小室实验检测细胞迁移能力;波形蛋白(Vimentin)和血小板-内皮细胞粘附分子(CD31)以及Notch-1的蛋白表达情况通过蛋白免疫印迹法检测。(2)分组:正常组,模型组(10 ng·mL^-1 TGF-β1),γ-分泌酶抑制剂组(10 ng·mL^-1 TGF-β1+15μmol·L^-1 DAPT),EOFAZ高剂量组(10 ng·mL^-1 TGF-β1+4μg·L^-1 EOFAZ)。DAPT及EOFAZ干预作用2 h后加入TGF-β1共同孵育72 h。通过蛋白免疫印迹法检测Notch-1,Snail和Slug的表达。结果:内皮细胞经TGF-β1处理72 h后,细胞迁移能力明显增强(P<0.01),CD31蛋白表达水平显著降低(P<0.01),Vimentin,Notch-1,Snail和Slug蛋白表达水平显著提高(P<0.01,P<0.05),给予EOFAZ作用后能逆转上述改变。同时在给予DAPT阻断Notch信号后,Notch-1,Snail和Slug蛋白水平下降(P<0.05)。结论:EOFAZ干预TGF-β1诱导EndMT的作用与Notch信号相关,其可以进一步调控Snail和Slug的表达。

氧化苦参碱抑制胰岛素诱导人结肠癌HT-29细胞的增殖及迁移作用

目的:利用胰岛素培养人结肠癌细胞HT-29,体外模拟糖尿病患者体循环中高胰岛素环境,研究氧化苦参碱(OMT)对胰岛素诱导的人结肠癌HT-29细胞增殖和迁移的影响。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法和平板克隆实验检测OMT(2,4,8 mmol·L^-1)对胰岛素诱导HT-29的增殖作用,倒置显微镜观察该模型下细胞形态的变化;通过划痕修复实验评价OMT对胰岛素诱导的HT-29迁移能力,流式细胞术Annexin V/碘化丙啶(PI)双染实验检测该模型中HT-29细胞周期与凋亡的变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞周期相关蛋白的表达以及细胞迁移相关蛋白的表达。结果:MTT比色法、平板克隆及划痕修复实验均显示,与空白组比较,胰岛素能促进人结肠癌HT-29细胞的增殖和迁移(P<0.05);选择2,4,8 mmol·L^-1OMT处理细胞24 h,与胰岛素组比较,OMT 4,8 mmol·L^-1明显抑制其增殖作用(P<0.05),可诱导HT-29细胞发生G0/G1期阻滞(P<0.05),8 mmol·L^-1OMT下调细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)表达(P<0.05),上调周期负调节蛋白p27水平(P<0.05);此外,划痕修复实验结果显示,与胰岛素组比较,OMT各浓度组均能抑制胰岛素诱导的细胞迁移作用(P<0.05),其机制可能与增加黏附蛋白(E-cadherin)(P<0.05)和降低波形蛋白(Vimentin)(P<0.05)相关。结论:OMT能抑制胰岛素诱导的人结肠癌HT-29细胞增殖及迁移作用,其作用机制可能与调控细胞周期及迁移相关蛋白有关。

艳山姜挥发油通过Nrf2/Notch1信号通路抑制高糖诱导的内皮间质转分化

目的:分析艳山姜挥发油(EOFAZ)抑制高糖(HG)诱导的内皮间质转分化(EndMT)的作用及其机制。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分析EOFAZ对HG诱导EndMT及氧化应激损伤的药效学作用,设定空白组,EOFAZ低、高剂量组(1,4μg·L-1),高糖组(35 mmol·L-1),EOFAZ预孵育2 h后加入HG共同孵育72 h复制EndMT细胞模型。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测波形蛋白(vimentin)和血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)的蛋白表达水平,血管生成实验检测细胞迁移能力以分析EOFAZ对EndMT的影响;采用2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测活性氧(ROS)水平的变化以及试剂盒法检测细胞内丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)的含量,以分析EOFAZ对氧化应激的影响;采用Western blot检测核转录因子E2相关因子2(Nrf2)与Notch1的蛋白表达水平。通过腺病毒(AD)转染实现Nrf2的过表达,进一步分析EOFAZ抑制EndMT的作用机制,设定空白组,AD-Nrf2+EOFAZ组(4μg·L-1),AD-Nrf2组,高糖组(35 mmol·L-1),EOFAZ组(4μg·L-1)。Nrf2基因重组腺病毒过表达质粒感染细胞6 h,更换为正常培养基24 h,EOFAZ预孵育2 h后加入HG共同孵育72 h诱导EndMT。通过Western blot检测Nrf2,CD31,vimentin,Notch1和Snail的蛋白表达。结果:与高糖组比较,EOFAZ干预给药后明显上调HG诱导的CD31蛋白表达水平和下调vimentin蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),降低细胞迁移能力(P<0.01),同时降低ROS和MDA的水平(P<0.05,P<0.01),提高CAT和SOD的水平(P<0.01)。此外,EOFAZ干预给药能够显著上调抗氧化信号Nrf2的蛋白表达水平(P<0.01),下调Notch1的蛋白表达水平(P<0.01)。通过稳定的腺病毒转染HUVECs可实现Nrf2的高表达,Western blot结果显示,与高糖组比较,各给药处理组显著提高Nrf2和CD31的蛋白表达水平(P<0.01),显著下调vimentin,Notch1和Snail蛋白表达水平(P<0.01);与AD-Nrf2组相比,AD-Nrf2+EOFAZ组能够进一步上调Nrf2和CD31的蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),降低vimentin,Notch1和Snail蛋白表达水平(P<0.01)。结论:EOFAZ可改善HG诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤,从而抑制EndMT,其作用与Nrf2/Notch1信号通路相关。

Synthesis and cytotoxicity of longistylin C derivatives

The present study was designed to identify potent anti-tumor compounds from a series of new longistylin C derivatives.Ten longistylin C derivatives were synthesized and their structures were confirmed by ~1H NMR,MS,and elemental analyses.Their cytotoxicity in vitro against three human cancer cell lines(A549,HepG2,and MCF-7) were evaluated by the MTT assay.Among these compounds,DT-6 and DT-9 displayed much better cytotoxicity against A549,HepG2,and MCF-7 cells,DT-1 exhibited selective cytotoxicity against HepG2,and the structure-activity relationships were investigated.In conclusion,Compounds DT-6 and DT-9 may serve as potential lead compounds for the discovery of new anti-cancer drugs.