柔嫩艾美耳球虫AMA1基因DNA疫苗的免疫保护效果

本研究旨在评价表达柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1(Apical membrane antigen 1,Et AMA1)基因的DNA疫苗对雏鸡柔嫩艾美耳球虫人工感染的免疫保护效果。将Et AMA1基因和鸡IFN-γ基因插入真核表达载体p CAGGS中,分别构建了真核表达重组质粒p CAGGS-Et AMA1和p CAGGS-Et AMA1-IFN-γ。将重组质粒p CAGGS-Et AMA1转染进293T细胞中,经间接免疫荧光和Western blot实验鉴定,观察其在体外表达情况。将p CAGGS-Et AMA1和p CAGGS-Et AMA1-IFN-γ于7日龄和14日龄腿部肌肉注射免疫雏鸡,21日龄人工感染1×10^4个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,第29日龄时处死试验鸡,以平均增重、卵囊产量和病变记分来评价重组质粒的免疫保护效果。结果显示,p CAGGS-Et AMA1转染的293T细胞出现明显的红色荧光;两种真核表达重组质粒免疫组鸡的平均增重与未攻虫组的平均增重差异不显著,不具有统计学意义,而未免疫攻虫组则与未攻虫组在增重方面差异具有显著统计学意义;免疫组鸡相较于未免疫攻虫组在病变记分方面显著下降;免疫组的卵囊减少率分别为67.43%和72.89%;p CAGGSEt AMA1-IFN-γ组在增重、盲肠病变记分和卵囊减少率方面都优于p CAGGS-Et AMA1组,但差异不具有统计学意义。表明构建的2种重组质粒对雏鸡柔嫩艾美耳球虫感染有一定的免疫保护效果。

世界牛球虫种类与地理分布

为全面了解牛球虫的种类及在世界各地的分布状况,本文收集整理了世界上有关牛球虫报道的文献,依虫种学名的字母为序,介绍了27种牛球虫,其中25种艾美耳球虫(Eimeria)、2种等孢球虫(Isospora),每种球虫包括中文名称与学名、宿主名称、寄生部位、致病性和地理分布,部分种类有同物异名,地理分布则按国家或地区的英文或拼音字母为序。在收录的60个国家中,分布最广的球虫为椭圆艾美耳球虫(52个国家),其次为奥博艾美耳球虫(50个国家),第三为牛艾美耳球虫和邱氏艾美耳球虫(均为48个国家),分布少于10个国家的种类占51.85%。报道球虫种类最多的国家为印度(20种),其次为中国(19种),第三为巴西(16种),报道少于10种球虫的国家占51.67%。本文能反映出牛球虫在世界范围内的基本分布状况,为全面了解牛球虫的种类与地理分布提供了一份较为完整的基础资料。

利用BiFC技术研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1结构域Ⅰ与棒状体颈部蛋白2互作关系

为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并与pGEM-T-easy载体连接构建相应重组质粒。获得的阳性重组质粒及双分子荧光互补技术的真核表达载体pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II进行双酶切,将E tAMA1-DⅠ、E tRON2分别与pBiFC-VN155、pBiFC-VC155连接,构建真核重组质粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。将2个真核重组质粒分别转染BHK细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,可在BHK细胞中成功表达。将2个真核重组质粒共转染至BHK细胞中,同时将pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共转染至细胞中分别作为阳性和阴性对照组。BiFC结果发现真核重组质粒共转染组和阳性对照组的BHK细胞均产生绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明E tAMA1-DⅠ与E tRON2蛋白之间存在互作关系。本研究结果为深入研究E tAMA1及E tRON2在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。

柔嫩艾美耳球虫伴侣蛋白TCP-1亚基α的特性和功能初步分析

柔嫩艾美耳球虫是一种重要的寄生于鸡盲肠细胞内的寄生原虫,可引起危害严重的鸡球虫病。目前,对鸡球虫病的预防和治疗主要依靠抗球虫药,而药物的广泛使用使球虫产生了严重的耐药性。为研究球虫耐药性产生的机制,本实验室前期对诱导的地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株和亲本敏感株进行转录组测序,经分析发现TCP-1亚基α为耐药株和敏感株的差异表达基因且在耐药株上调表达。本文以柔嫩艾美耳球虫敏感株为模板,成功克隆出TCP-1亚基α基因,构建了原核表达重组质粒p ET-Et TCP-1α,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TCP-1α,用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔和BALB/C小鼠获得多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法检测柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株TCP-1亚基α基因的m RNA转录和翻译水平,同时检测了该基因在球虫不同发育阶段的转录水平和翻译水平。结果显示,Et TCP-1α在2个耐药株的m RNA转录和蛋白翻译水平明显高于敏感株,而且该蛋白在第二代裂殖子的表达最高;间接免疫荧光实验显示该蛋白主要位于子孢子和第二代裂殖子表面,当虫体入侵DF-1细胞进行裂殖生殖后,该蛋白分布于整个虫体,且表达量明显升高。因此,推测Et TCP-1α在柔嫩艾美耳球虫细胞内的生长发育和耐药性的产生过程中发挥了一定的作用。

免疫共沉淀联合质谱技术筛选柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3互作蛋白

为探究柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(EtCDPK3)在钙离子信号通路中是如何将信号传递给下游效应分子,进一步促进虫体入侵宿主细胞的机制,以柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白及其单克隆抗体和多克隆抗体为实验材料,利用免疫共沉淀技术筛选EtCDPK3的互作蛋白并进行质谱鉴定分析,使用Maxquant软件对获得的原始数据进行分析。SDS-PAGE结果显示,与阴性对照组相比,2个样品组出现差异条带;免疫共沉淀洗脱液质谱鉴定分析结果显示,获得6个可能与EtCDPK3相互作用的相关蛋白。以上实验结果为进一步深入研究EtCDPK3在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞过程中的作用奠定基础。

基于iTRAQ技术分析柔嫩艾美耳球虫感染后CEF细胞的差异表达蛋白

柔嫩艾美耳球虫是一种严格的细胞内专性寄生虫,可主动入侵鸡的盲肠上皮细胞。当受到柔嫩艾美耳球虫感染时,宿主细胞会发生相应的变化以应对感染引起的损伤。迄今为止,对宿主细胞应对球虫感染机制的研究极其有限。本研究利用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术分析了感染柔嫩艾美耳球虫子孢子72 h后原代鸡胚成纤维(CEF)细胞的蛋白质组表达变化,结果共鉴定出3967个非冗余蛋白质,与不感染组相比,感染组有259个蛋白质的表达量发生了明显变化,其中上调蛋白质145个和下调蛋白质114个;GO和KEGG通路分析结果发现,这些差异表达蛋白具有结合活性、催化活性、转运子活性等分子功能,主要参与细胞外基质受体互作、糖酵解/糖异生、粘着斑、氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等通路;qPCR结果发现,8个基因的mRNA转录水平变化与iTRAQ结果一致,2个基因的不一致;Western blot结果发现感染组细胞的FABP4蛋白表达量显著降低,与iTRAQ结果中蛋白表达水平变化相一致。本研究结果为柔嫩艾美耳球虫与宿主之间互作关系的深入研究提供了重要的基础数据。

单核苷酸多态性在寄生虫上的应用

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)作为第三代分子标记,由于其检测方法多样,具有数量多、二态性和遗传稳定性高等众多优势,在人类和动植物领域均有广泛的应用,有着很高的研究价值和应用前景。本文从SNP分子标记简介出发,简述了SNP在生命科学领域的应用概况,对SNP在寄生原虫、蠕虫、节肢动物上的研究进展进行综述,涉及寄生虫的遗传发育、种群进化、致病性及耐药性等方面,为了解SNP在寄生虫领域的应用现状和开展寄生虫的相关研究提供了基础资料。

活化蛋白激酶C受体1影响柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的初步研究

在前期实验中,本实验室利用i TRAQ技术研究了柔嫩艾美耳球虫子孢子感染宿主细胞后蛋白质组学的变化,获得了一批与子孢子入侵相关的宿主蛋白。本研究以鸡肌肉的c DNA为模板,对其中活化蛋白激酶C受体1(receptor for activated C kinase1,RACK1)进行克隆、表达及纯化,结果显示,成功获得RACK1-GST融合蛋白,并作为免疫原制备兔抗RACK1-GST多克隆抗体;利用RT-q PCR和Western blot检测子孢子感染DF-1细胞过程中RACK1的m RNA转录水平和蛋白表达水平。结果显示,子孢子感染细胞24~72 h时,细胞RACK1的转录水平和蛋白表达水平均明显提高;利用抗体抑制入侵试验检测RACK1多抗对子孢子入侵细胞的影响,结果显示,100μg/m L和200μg/m L RACK1-GST抗体作用细胞后对子孢子的入侵影响不大,而300μg/m L和400μg/m L作用细胞后能明显促进子孢子的入侵。以上结果表明,宿主RACK1对球虫子孢子入侵细胞起负调控的作用,但具体机制尚需深入研究。

Resistance of Eimeria Coccidia Isolated from Two Chicken Farms in Anhui Province to Eight Anticoccidial Drugs

[ Objectivel To investigate the sensitivity of Eimeria coccidia strains isolated from two chicken farms in Anhui Province to different anticoccidial drugs and provide a theoretical basis for coccidiosis treatment. [ Method] The fresh feces were collected from two chicken farms, and Eimeria coccidia strains were isolated and propagated in laboratory. A total of eight anticoccidial drugs including diclazuril, robenidine, dinitoimide, decoquinate, nicarbazine, maduramicin, salinomycin and lasalocid were selected for sensitivity test. [ Results] In Farm I, Eimeria coccidia strains were sensitive to decoquinate, partially resistant to nicarbazine and completely resistant to other six drugs. In Farm II, Eimeria coccidia strains were sensitive to decoquinate and nicarbazine, partially resistant to robenidine and completely resistant to other five drugs. [ Conclusion] Drug resistance of Eimerfa coccidia to many anticoccidial drugs had been highly developed in these two farms.

柔嫩艾美耳球虫NADP特异性谷氨酸脱氢酶特性分析

为了研究柔嫩艾美耳球虫NADP特异性谷氨酸脱氢酶(EtNADP-GDH)的分子特性,对该基因进行了克隆和生物信息学分析,利用间接免疫荧光定位、体外入侵抑制、实时荧光定量PCR、Western-blot和体外酶活性检测等方法分析其生物学特性。结果显示,成功获得了EtNADP-GDH基因,该基因编码的蛋白富含包括NAD结合位点在内的多种功能位点。该蛋白主要分布在虫体的表面和细胞质中,抗rENADP-GDH多克隆抗体能抑制子孢子入侵DF-1细胞,抑制率约为45%,表明其参与了虫体入侵宿主细胞。荧光定量PCR结果显示,该基因在未孢子化卵囊阶段的转录水平最高;转录、翻译水平分析发现,与敏感株相比,2个耐药株(地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株)中EtNADP-GDH的转录水平显著提高,而翻译水平无明显差异;酶活性分析结果显示,耐药株和敏感株差异不明显。结果表明,该蛋白可能对虫体在宿主细胞内的生长发育起作用并参与了子孢子入侵宿主细胞的过程。