黄鹂无齿鲹胚胎及胚后发育特征

黄鹂无齿鲹是一种兼具观赏与食用价值的名贵海水鱼类。本文通过人工催产方法,获取黄鹂无齿鲹受精卵并追踪观察,旨在对其胚胎及胚后发育特征进行观察记录。结果显示,受精卵孵化条件为盐度30.26±0.67、温度(24.72±0.32)°C、pH值(7.46±0.12)、溶解氧(5.13±0.33)mg/L、光照强度约3000 lx。黄鹂无齿鲹受精卵为透明浮性圆球形,平均卵径(764.29±14.74)μm;含单油球,油球平均直径(166.32±18.28)μm。胚胎发育历经受精卵期、胚盘期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期与孵化出膜期8个阶段,再进一步细分成24个时期。受精后18 h 30 min孵化出膜,进入仔鱼阶段(含前仔鱼期和后仔鱼期)。前仔鱼期为孵化后0~3 d,卵黄囊没有完全吸收;后仔鱼期为孵化后4~20 d,卵黄囊完全吸收。初孵仔鱼全长(1520±19)μm,出膜后第6天油球储备耗尽并形成鳔。孵化后第20天,鱼体后脊索完全弯曲,各鳍和消化系统发育完善,体表大量色素沉淀且具有独立生活的能力,仔鱼进入稚鱼阶段。研究表明,黄鹂无齿鲹的发育模式符合典型硬骨鱼类的规律,发育周期较其他鲹科鱼类更短,其胚胎及胚后发育特征与卵形鲳鲹比较接近。本研究为黄鹂无齿鲹苗种培育提供了重要参考。

盐度对中华绒螯蟹繁殖特性及胚胎质量的影响

为探究盐度对中华绒螯蟹亲体繁殖特性及所产胚胎质量的影响,开展了不同盐度(3、6、9、12、15、18、21)下亲体的生殖产卵实验,分析了各盐度下亲体的产卵量、生殖指数和生殖力等繁殖特性及所产胚胎的卵径、重量、生化成分和脂肪酸组成。结果显示:①中华绒螯蟹产卵的最低盐度为6,在盐度6~21的范围内,中华绒螯蟹亲本的产卵量、生殖指数和生殖力均表现为先升高后下降的趋势,其中盐度18时,亲本的产卵量、生殖指数和生殖力均最高,且与其他各组都有显著差异。②盐度6时胚胎直径最大,平均为(391.13±12.27)μm,显著高于其他各组。盐度12时单个胚胎湿重和干重均最高,分别为(50.64±2.80)μg和(14.85±0.31)μg,且与其他各组均有显著差异。③随盐度的增加,中华绒螯蟹胚胎的粗蛋白、总脂肪和水分含量都呈现先升高后降低的变化趋势。其中盐度15时,胚胎中粗蛋白、总脂肪和灰分含量均达到最高,平均分别为(20.64%±3.42%)、(8.65%±1.44%)和(1.30%±0.22%)。各盐度下胚胎水分含量无显著差异。胚胎中胆固醇和磷脂含量均随盐度的增加呈现出先上升后下降的变化趋势,甘油三酯的含量变化则不明显。④中华绒螯蟹胚胎中共检测出19种脂肪酸,其中饱和脂肪酸7种,单不饱和脂肪酸4种,多不饱和脂肪酸8种。盐度6时,胚胎中C20:4n6(ARA)、C20:5n3(EPA)和C22:6n3(DHA)的含量均最高,平均分别为(0.0098%±0.0011%)、(0.4300%±0.0044%)和(0.0652%±0.0008%),且都显著高于其他各盐度组;盐度21时,饱和脂肪酸(SFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)总量均最高,且与其他各组有显著差异。研究表明,盐度对中华绒螯蟹所产胚胎质量有一定影响,盐度18时中华绒螯蟹的繁殖特性最好。

盐度对紫海胆受精、胚胎发育、幼体生长、摄食和变态的影响

为研究盐度对紫海胆受精、孵化、胚胎发育、浮游幼体生长发育、摄食和变态的影响,本研究采用实验室培养幼体的方法,设置了不同盐度(15、20、25、30、35和40)的水体,对紫海胆的胚胎和浮游幼体进行实验。结果显示,紫海胆在盐度20~35范围内的受精率超过95%,但在盐度15和40下无法受精;盐度30下胚胎发育最快,孵化率显著高于其他盐度,为89.8%;浮游幼体期适宜盐度为25~35,最适盐度为30,盐度20和40下幼体仅能发育至八腕幼体Ⅰ期,而盐度15下幼体发育受抑制,一直停留在四腕幼体阶段,7 d后死亡;盐度为15~40时的八腕Ⅳ期幼体在72 h的变态率超过21.4%,其中盐度30下幼体变态率最高,为54.7%,且变态速率最快,能在24 h时出现稚胆。浮游幼体在盐度35时前侧腕和口后腕生长最快,胃面积在盐度30时最大,摄食率在盐度30时最大。研究表明,盐度对紫海胆的早期发育有较显著的影响。本研究能够为紫海胆人工育苗培育提供基础资料。

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长、体外成熟、体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于添加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟。单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用。将体外受精后发育至２—细胞的胚胎移植入受体鼠，胚胎可以正常着床发育。同时，卵母细胞的核仁和线粒体在培养过程中也发生相应的变化。

Wnt抑制因子-1在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因小鼠中的表达变化

目的检测Wnt抑制因子-1(Wif-1)在成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型小鼠脊髓内的表达变化,进一步探讨Wif-1在ALS发病中的作用。方法选取ALS转基因鼠和同窝野生型鼠各54只,分别于鼠龄95d、108d、122d取材,部分鼠经4%多聚甲醛心脏灌注固定、分离脊髓、制备冷冻切片,应用免疫荧光染色技术检测脊髓内Wif-1的分布及变化;部分鼠取出脊髓、匀浆,应用RT-PCR和Western blotting方法观察不同时间点Wif-1 mRNA及其蛋白表达水平变化。结果成年ALS转基因鼠和同窝野生型鼠脊髓的中央管、灰质、白质中均可检测到Wif-1阳性细胞,在灰质内,Wif-1阳性细胞主要分布于脊髓前角;在白质内,神经元的轴突呈阳性反应。与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠Wif-1阳性细胞显著增多,Wif-1 mRNA和蛋白表达在95d变化不明显,在108d、122d均有升高,差异具有统计学意义(P<0.05),其中108d升高最明显。结论在ALS转基因鼠发病过程中Wif-1阳性细胞明显增多,Wif-1 mRNA和蛋白表达升高,表明Wif-1与ALS的发生密切相关。

双重套式PCR对不同取样胚胎性别鉴定灵敏度测试

目的 :测定双重套式PCR微量扩增体系的灵敏度 ,为附植前遗传学诊断 (PGD)、家畜胚胎性别鉴定等提供技术保障。方法 :以桑椹胚卵裂球为模板进行扩增 ,建立昆明白小鼠特异的SRY ZFX双重套式PCR性别鉴定体系。按卵裂球数量的不同分为五组 ,对应的卵裂球个数分别为 1、2、3、4、5及以上。根据有效扩增结果得出双重套式PCR的灵敏度。结果 :第 1组 (卵裂球个数为 1 ) ,有效检出率为 85 % ( 34 /40 ) ,污染率为 7 5 % ( 3 /40 ) ,漏检率为 7 .5 % ( 3 /40 )。随着卵裂球个数的增多 ,有效检出率逐渐升高 ,而污染率和漏检率则呈逐渐下降趋势。第 5组 (卵裂球达到 5及以上 ) ,有效检出率达到 1 0 0 % ,漏检率为 0。对于第 2、3、4、5组而言 ,有效检出率及漏检率各组间并无显著差异 (P >0 . 0 5 ) ;而第一组与其它各组间 ,有效检出率及漏检率存在显著差异 (P <0 .0 5 )。结论 :双重套式PCR可以有效扩增基因组DNA量约为 1 2pg的模板 ,且扩增片段为单拷贝片段。

一种改进的胚胎吸管

一种改进的胚胎吸管(王氏管)由直径25mm的玻璃细管和硅胶管组成。该管制作使用方便,容易操作,不易污染,价格低廉。连接部分采用全塑料和硅胶管。具有安全、耐用、无毒性等特点。适用于各种胚胎操作。

胚胎干细胞的体外扩增

探讨了胚胎干细胞在体外大量扩增的方法。将胚胎干细胞复苏后,选择合适的培养基(含高糖和谷氨酰胺的DMEM,加入φ=20%胎牛血清,105U L青链霉素双抗,0 1mmol LL＿谷氨酰胺,103IU L白血病抑制因子,0 1mmol Lβ＿巯基乙醇)进行培养。此外,使用早代胚胎干细胞;培养时使用不涂明胶的一次性培养瓶;掌握好消化、复苏和冻存时机并及时换液;按照严格步骤进行培养、传代、冻存。对扩增后的ES细胞进行染色体和全能性检测。结果表明,在较短时间内(5d)可将胚胎干细胞扩增16倍以上。扩增后的ES细胞较好地保持了胚胎干细胞的全能性和核型。可见使用合适的培养基,按照严格步骤操作,短期内完全可以大量扩增胚胎干细胞。

四倍体胚胎发育阶段对胚胎干细胞嵌合体小鼠制备的影响

目的探讨四倍体胚胎发育阶段对胚胎干细胞(ES)嵌合体小鼠制备的影响。方法通过2-细胞胚胎电融合法制备四倍体胚胎,采用显微注射方法将ES细胞分别注入1-细胞、4-细胞、囊胚3个发育阶段的四倍体胚胎中。所用ES细胞分别为杂交系B6D2F1×129/Sv和近交系C57BL/6J,经胚胎移植和剖腹产以获得ES小鼠。结果实验表明,2-细胞胚胎电融合率为92.45%,4-细胞胚胎发育率为93.51%,囊胚发育率为90.42%。杂交ES细胞注射四倍体囊胚获得22只ES小鼠,效率显著高于近交系ES细胞以及其他发育阶段的四倍体胚胎,ES小鼠与B6D2F1×129/Sv杂交小鼠毛色一致且具有正常生殖能力。结论四倍体胚胎的发育阶段显著影响ES小鼠的制备。

昆明系小鼠体外受精方法及一种新培养基的应用

目的：为研究受精卵早期发育机理提供大量、同步分裂的受精卵；寻找一种更好的受精卵体外培养基。方法：小白鼠超排取卵，附睾取精，建立体外受精模型。并比较不同培养液对受精卵发育的影响。结论：建立了昆明系小鼠的体外受精模型。受精２４ｈ后，Ｍ１６和ＫＳＯＭ分别有３１．５％和４８．７％发育到２－细胞期；受精４８ｈ后，则分别有１５．７％和５３．６％发育到４－细胞期。结论：ＫＳＯＭ在一定程度上克服“二细胞阻滞”

利用四倍体胚胎补偿法制备ES小鼠的技术方法

目的介绍四倍体胚胎补偿法制备ES小鼠技术的操作环节,加快该技术的推广应用。方法综合分析近几年来国内外在小鼠四倍体胚胎与ES细胞嵌合的研究成果,并结合我们自己的实验结果,分析影响ES小鼠制备的各种因素。结果四倍体胚胎不能正常发育至妊娠期末,通过四倍体胚胎与胚胎干(ES)细胞的嵌合可以得到完全由ES细胞发育而来的小鼠,即ES小鼠。同核移植小鼠相比,ES小鼠具有正常的形态、生理和神经特征。ES细胞和四倍体胚胎的遗传背景、ES细胞的生长状态、嵌合方法、培养基种类、体外培养环境、移植方法、继母母性等是影响ES小鼠生活力的重要因素。结论利用四倍体胚胎补偿法可以简便而快速地从遗传修饰的ES细胞获得突变体小鼠,为研究基因功能和构建人类疾病动物模型提供了一条有效途径。

小鼠原生殖细胞体外培养及其应用研究

原生殖细胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌｇｅｒｍｃｅｌｌ，ＰＧＣ）是胚胎生殖谱系最原始形式的细胞，在体胚胎迁移期ＰＧＣ增殖极为旺盛。体外培养的小鼠迁移期ＰＧＣ在饲养层细胞和三种生长因子（干细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及白血病抑制因子）的共同作用下，可发展为长期增殖并维持不分化状态的胚胎性干细胞，即胚胎生殖细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌ，ＥＧ），具全能性发育潜能。ＥＧ建系成功对于研究生殖细胞发育以及寻找新的转基因动物操作的有效载体具有重要价值。

成年肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓细胞增殖的研究

目的观察成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内源性细胞的增殖和存活情况。方法对ALS转基因鼠进行BrdU注射,分别于不同时间点取材,冷冻切片,应用免疫荧光染色技术检测脊髓内细胞的增殖、分布和存活情况。结果成年ALS鼠脊髓的中央管、灰质、白质均可检测到BrdU阳性细胞,经常可检测到形状相似、成对出现的细胞。在灰质内,BrdU阳性细胞主要分布于脊髓前角。在白质内,BrdU阳性细胞散在分布。前角ALS鼠脊髓内BrdU阳性细胞数量较野生型鼠多。BrdU末次注射后1d、14d均可检测到BrdU阳性细胞,但细胞数量逐渐减少,28d ALS鼠脊髓内仍可检测到少量BrdU阳性细胞,主要分布于中央管部位。增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞的分布和变化规律与BrdU阳性细胞一致。在95d龄ALS鼠(BrdU末次注射1d后),脊髓中Nestin阳性细胞较野生型鼠多,多数Nestin阳性细胞分布于脊髓前角,某些细胞呈BrdU/Nestin双标阳性。在BrdU注射后14d、28d脊髓中,未检测到BrdU/Nestin双标阳性细胞。结论神经退行性病变可激活ALS转基因鼠脊髓的细胞增殖,且细胞存活可达28d。

成年肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓增殖细胞的分化

目的探讨成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内增殖细胞的类型及分化情况。方法对ALS转基因鼠发病期进行BrdU标记,分别于不同时间点取材,冷冻切片,应用免疫荧光双标及三标染色技术检测ALS转基因鼠病变进展过程中脊髓内增殖细胞的分化情况。结果成年ALS转基因鼠发病期脊髓的中央管、灰质、白质均未检测到BrdU/DCX双标记阳性细胞和BrdU/NeuN双标记阳性细胞。灰质、白质和中央管周围检测到大量NG2阳性细胞,阳性细胞数量随病变进展逐渐减少,NG2阳性细胞多呈BrdU阳性表达;可检测到少量BrdU/A2B5双标记阳性细胞;ALS转基因鼠发病期脊髓BrdU/GFAP双标记阳性细胞较多,部分双阳性细胞呈Nestin阳性,而野生型鼠脊髓内未检测到BrdU/GFAP双标记阳性细胞。结论神经退行性病变激活ALS转基因鼠脊髓内源性增殖细胞向神经胶质细胞方向分化,未检测到向神经元方向分化,内源性增殖细胞尚不能有效地促进退行性病变的修复。

人早孕绒毛膜匀浆和脐静脉内皮细胞对早期鼠胚体外发育的影响

目的:观察人早孕绒毛膜匀浆(UPHC)和人脐静脉内皮细胞(ECHUV)对早期鼠胚体外发育的影响。方法:观察早期鼠胚在UPHC培养液及ECHUV联合培养液中的发育情况;用ELISA法检测两培养系统上清液中表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和血管内皮生长因子(VEGF)的含量。结果:在UPHC培养系统和ECHUV联合培养系统中,早期鼠胚的桑葚胚形成率分别为79.5%和81.2%,囊胚形成率分别为60.2%和61.2%,囊胚孵出率分别为41.0%和42.1%,均明显高于对照组(P<0.05)。早期鼠胚A和B级桑葚胚形成率,在UPHC培养系统中分别为45.2%和32.3%,在ECHUV培养系统中分别为44.6%和27.7%,均显著高于对照组(P<0.05)。UPHC培养系统和ECHUV联合培养系统中,EGF的浓度分别为(52.65±7.37)pg/ml和(58.14±3.03)pg/ml;GM-CSF的浓度分别为(11.81±3.76)pg/ml和(9.20±2.59)pg/ml;VEGF的浓度分别为(61.43±11.38)pg/ml和(256.54±9.15)pg/ml,均显著高于对照组(P<0.05);ECHUV培养系统的VEGF浓度又显著高于UPHC培养系统(P<0.01)。结论:UPHC和ECHUV培养系统促进早期鼠胚体外发育,提高桑葚胚和囊胚形成率、囊胚孵出率和胚胎质量,其作用与EGF、GM-CSF及VEGF有关。

离体培养条件下不同育性油松胚珠发育的细胞学观察

离体培养条件下观察比较28号雌性不育系和遗传背景相近的14号可育系油松胚珠的发育过程。结果表明，在离体培养条件下，两种育性不同的胚珠发育过程不同，可育系胚珠及其雌配子体在培养过程中体积明显增大，雌配子体中的游离核在培养前期能正常分裂，其数目从500～600个增加到2000多个．培养后期，胚珠珠心、珠被等组织过度生长，雌配子体出现缺口，游离核流失而停止发育；不育系胚珠在培养过程中体积增大，其雌配子体体积只略有增大，游离核在培养初期就停止分裂，同自然条件下的败育现象一致。但两系胚珠的珠心、珠被等组织均能继续进行细胞分裂、组织增生，后期仍能产生大量愈伤组织，生长情况基本相同。试验结果表明油松胚珠中二倍体细胞有丝分裂与雌配子体游离核有丝分裂是两个相对独立的过程，其调节机制不尽相同。

体外受精-胚胎移植妇女体内颗粒细胞线粒体活性和左旋肉碱水平的关系

目的探讨行IVF-ET妇女体内颗粒细胞线粒体活性与血浆、卵泡液左旋肉碱水平三者的关系,及其与年龄、优胚率、受精率及妊娠结局等的关系。方法应用流式细胞仪法测定颗粒细胞线粒体活性,柱前衍生-高效液相色谱法测定游离左旋肉碱水平。结果妊娠组颗粒细胞线粒体活性高于未妊娠组(P<0.05)。颗粒细胞线粒体活性与年龄呈负相关,与受精率、正常受精率、优胚率呈正相关(P<0.05)。妊娠组卵泡液左旋肉碱水平低于未妊娠组(P<0.05),血浆左旋肉碱水平与年龄呈正相关(P<0.05),血浆左旋肉碱水平与颗粒细胞线粒体活性呈负相关(P<0.05)。结论颗粒细胞线粒体活性的降低可能与年长妇女IVF-ET受精率低、胚胎质量差、妊娠结局差有关。妇女体内颗粒细胞线粒体活性下降时,血浆左旋肉碱水平可能代偿性增加。

BRL条件培养基在ES细胞培养中的应用方法探讨

目的 :探讨布法罗大鼠肝细胞条件培养基 (Buffaloratlivercellconditionedmedium ,BRL)在ES细胞培养中的应用方法。方法 :ES细胞复苏后分别培养在BRL条件培养基、小鼠胚胎成纤维细胞饲养层 (mouseembryonicfibroblast,MEF)及合并应用BRL条件培养基和MEF饲养层的环境中 ,通过细胞计数、拟胚体计数和ES细胞集落边缘细胞分化状态比较ES细胞在三种培养基中生长和分化差异。结果 :与BRL组比较 ,MEF组和BRL +MEF组细胞生长较快(P <0 .0 1) ,ES细胞集落边缘分化细胞较少 ;MEF组和BRL +MEF组无明显差异。结论 :在复苏后早期阶段ES细胞培养中 ,不宜单独应用BRL条件培养基 。

DAP玻璃化冷冻液对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保存

目的探索和优化小鼠2-细胞胚胎冷冻效果,建立小鼠胚胎冷冻保存技术以及超低温保存模型动物胚胎实验室所需的相关技术。方法选择3个品系(C57BL/6、Apo E-/-、NOS3-/-)SPF级4周龄雌性小鼠,运用超数排卵、体外受精、玻璃化冷冻法,以及二细胞期胚胎复苏、体外培养等技术方法,观察上述实验效果。结果 C57BL/6、Apo E-/-、NOS3-/-3个品系小鼠超数排卵平均值分别为42.98个/只、27.93个/只、23.11个/只,体外受精2-细胞期胚胎率分别为68.79%、32.70%、23.08%,胚胎冷冻复苏后胚胎回收率72.77%、80.87%、83.33%,存活率分别为56.92%、54.84%、70%,存活胚胎体外培养发育到囊胚比率分别为72.37%、60.78%、25%。结论选择4周龄小鼠,按预定相同的技术方法做超数排卵、体外受精、胚胎冻存、胚胎复苏,呈现出较好效果,C57BL/6小鼠优于基因工程小鼠,基本建立起小鼠2-细胞胚胎冷冻保存技术。