TUB2基因鉴定及其在毛壳菌中的转化

TUB2基因为植物病原菌抗苯并咪唑类杀菌剂基因 .以pRB12 9质粒为模板对该基因进行PCR扩增 ,得到一条长约 1 4kb的DNA片段 ,经酶切鉴定证明该DNA片段是TUB2基因 .利用PEG方法 ,将含有TUB2基因的pRB12 9质粒转化于毛壳菌原生质体中 ,并在高于毛壳菌敏感的多菌灵浓度 (10 μg mL)下筛选转化子 ,此质粒转化率为 3 (2× 10 5) .使得对多菌灵非常敏感的毛壳菌能够在 30 0 μg mL多菌灵的培养基上正常生长 ,其抗药性提高了30 0倍以上 ,而且转化子稳定性试验表明 ,其抗药性在非选择性培养基上连续培养 10代保持不变 .

质粒DNA快速提取法在基础课实验中的应用

本文对质粒DNA及其结构、形态和功能进行了综述,介绍了快速提取质粒DNA的基本步骤,并对其提取过程中的注意事项进行了剖析,分析了该方法的优点.

质粒pMC73A从催娩克氏菌到相思根瘤菌的接合转移

用接合转移的方法把质粒pMC73A转入相思根瘤菌MZ,接合转移的频率为8.0×10-8。实验表明:pMC73A能在接合子中稳定存在。

人tRNA^(ser)基因真核表达质粒的构建及对FRL-19肝癌细胞的高效转染

目的:构建人tRNAser(CGA)基因与真核表达载体pSV2neo的重组体,探讨细胞高效转染新方法,研究tRNA种类及丰度对转录后翻译水平的影响;为探索基因治疗新思路打下基础。方法:EcoRI酶切pGEM-TeasytRNAser(CGA)质粒释放目的基因tRNAser(CGA)片断,与pSV2neo载体构成重组体,双酶消化鉴定重组载体插入方向。扩增纯化构建的pSV2neotRNAser(CGA)质粒,经脂质体和Plus试剂混合包装,转染FRL-19肝癌细胞株。用Hirt方法提取胞浆DNA,做Southernblot。结果:用Nsil和BamHI双酶切鉴定获得正确方向的重组质粒pSV2neotRNAser(CGA),DNA测序显示其序列正确。Southernblot结果显示:在400bp处可见一条特异DNA条带,说明pSV2neotRNAser(CGA)已转入FRL-19细胞。结论:成功构建人pSV2neotRNAser(CGA)真核表达质粒。Plus试剂可明显提高脂质体转染FRL-19细胞的效率。

大蒜芦荟液消除R质粒的实验研究

目的:探讨大蒜芦荟混合液对大肠杆菌耐氯霉素(CM)R质粒和痢疾杆菌耐氯霉素(CM)R质粒消除作用。方法:将大蒜芦荟混合液作为R质粒消除剂,消除痢疾杆菌耐CM质粒和大肠杆菌耐CM质粒。结果:经大蒜芦荟液作用的大肠杆菌和痢疾杆菌在含CM中国蓝培养基和含CMSS培养基均不生长,但在不含CM中国蓝培养基和不含CMSS培养基都能生长。结论:大蒜芦荟混合液对大肠杆菌和痢疾杆菌的R质粒在体外均具有消除作用,说明大蒜芦荟液有预防肠道菌耐药性作用。

构建表达IL-10的重组乳酸杆菌

目的构建表达IL-10的重组乳酸杆菌。方法人工合成信号肽系列后与IL-10基因连接后克隆到干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei,L.casei)整合型表达载体pIlac的lac启动子下游,得到重组质粒pIlac-sp-IL10,电穿孔转化L.caseiCECT 5276。挑选转化后的耐药菌落在含红霉素的培养基中培养,抽提染色体DNA,PCR及测序鉴定证实IL-10基因是否整合到L.casei的基因组中,Western blot检测重组蛋白表达。结果 IL-10基因整合到干酪乳酸杆菌的基因组中;重组L.casei产生的目的蛋白部分分泌进入培养上清。结论 IL-10在L.caseiCECT 5276中得到了分泌表达。

水稻叶绿体转化载体pBS的构建及融合基因功能的初步鉴定

利用PCR方法分别从载体pchN-CAT-Bar和Psk51中分离得到编码膦丝菌素乙酰转移酶基因bar和绿色荧光蛋白基因sgfp,并在bar基因前段连接T7 leader sequence/5′-UTR和T7 10 N-terminus的8个氨基酸序列.运用融合PCR技术,得到bar和sgfp的融合基因片段BS.以水稻叶绿体基因组中的trnI和trnA为同源重组片段,来自烟草叶绿体16S rRNA的Prrn为启动子,psbA基因的TpsbA为终止子,融合片段作为双效筛选标记,构建水稻叶绿体转化载体pBS.大肠杆菌原核表达检测到明显荧光,基因枪轰击TP309愈伤,筛选抗性愈伤.

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-1基因重组真核表达质粒的构建及其对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的构建含人还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-1(NOX1)基因重组真核表达质粒,探讨其对血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响。方法通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库查找NOX1基因的mRNA序列,针对蛋白质编码区(CDS)设计引物,以人c DNA为模板扩增出NOX1基因全长CDS序列,经双酶切鉴定后,将NOX1基因与真核表达载体pc DNA3.1(+)连接,再经双酶切、测序鉴定。运用脂质体转染重组体pc DNA3.1(+)-NOX1至VSMC中,观察NOX1表达及VSMC凋亡情况。结果重组体中NOX1基因片段和载体DNA大小与预期一致。经BLAST(the basic local alignment search tool)比对,与NCBI数据库中的NOX1基因序列具有高度的同源性。pc DNA3.1(+)-NOX1能促进VSMC中NOX1蛋白高表达,并促使VSMC的凋亡。结论 NOX1基因重组真核表达质粒能促使VSMC凋亡,为阐明NOX1在主动脉夹层中的作用及分子机制研究奠定了基础。

细菌质粒及其在基因工程中的应用

细菌质粒作为一种特殊的遗传结构不仅在微生物遗传中起着基因库的作用 ,而且将其应用在基因工程中 ,使转基因生物在工业、农业、医学等各个领域都发挥着极大的作用。扩大了人类的生存空间 ,为解决 2

U937单核细胞几种不同转染方法的比较

目的采用不同质粒转染方法介导重组pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒转染U937单核细胞,以获得较高转染效率的方法。方法分别采用电穿孔法、Effectene转染试剂、Lipofectamine 2000转染试剂、电穿孔+Effectene转染试剂、电穿孔+Lipofectamine 2000转染试剂及HilyMax转染试剂等不同方法介导质粒进行转染,测定不同方法的转染效率、目的基因mRNA表达水平及其对细胞活力的影响。结果电穿孔+Effectene转染试剂组、电穿孔+Lipofectamine 2000组及HilyMax组的转染效率和目的基因mRNA表达较高,且HilyMax组对细胞活力影响较小。结论将重组pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒体外成功转染入U937单核细胞中,通过优化转染方法提高转染效率、降低对细胞活力的影响,为基因治疗提供了实验基础。

Lipofectamine 2000介导重组siRNA质粒载体转染SGC7901的条件优化

目的寻求Lipofectamine 2000介导外源基因体外转染胃癌细胞SCG7901的最佳条件,建立有效的转染体系。方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,统计分析在不同质粒与脂质体的用量比、培养基选择、转染作用时间等条件下脂质体介导外源基因导入胃癌细胞的效率。结果用24孔板培养细胞时,在细胞融合度约90%,质粒用量为0.6μg,脂质体用量1.2μl(两者质量/体积比为1:2),转染作用时间为8 h时,转染效率为465%%,细胞存活率约78%。结论按以上转染体系,可获得较为满意的结果。

RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

目的:构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经Eco RⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK 293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK 293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数(MOI)为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2 mg·L^-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果:PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×10^8 TU·mL^-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×10^8 TU·mL^-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%(t=11.44,P=0.0076)。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%(t=6.374,P=0.0078)。结论:成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平明显降低。

遗传性视神经病变相关线粒体动力学和基因异常研究进展

遗传性视神经性疾病是以视神经退行性病变为主的一组疾病的统称。遗传性视神经病变发病中存在视网膜神经节细胞线粒体动力学异常和线粒体基因突变、进而导致线粒体功能障碍,从而引起神经节细胞凋亡等。现简要综述线粒体动力学相关融合、分裂蛋白及其突变所引起的视神经相关疾病,着重阐述与遗传相关视神经病变相关的线粒体动力学异常引起的神经元变性与视神经性疾病之间的相关性,以及相对应的线粒体相关基因的异常,为遗传学视神经病变发病机制中线粒体功能失调机制研究提供依据。

运用荧光素酶报告基因建立PPARγ1的转录激活系统

核转录因子PPARγ与多种重大的疾病有密切关系 ,是近年来基础研究的热点及重要药物筛选靶点 .作者将一个表达PPARγ1全蛋白的重组质粒转染人Jarket细胞 ,通过RT PCR确定其表达后 ,与另一个含有PPRE元件和荧光素酶报告基因的质粒 pTK PPRE瞬时共转染细胞 ,检测到较高水平表达的荧光素酶 .将共转染的细胞以PPARγ的强激活物 15d PGJ2刺激后 ,荧光素酶的表达水平大幅度上升 .实验结果表明 ,已成功地建立了PPARγ转录激活系统 .这对于PPARγ激活剂的研究开发及相关基础研究具有重要作用 .

Theta复制A类质粒的研究进展

质粒主要存在于古细菌、细菌和真核细菌等领域[1-3],其通过重组或转座来整合和传递基因,促进细菌种群的遗传交换。质粒携带的基因赋予宿主细菌新的表型,让细菌更好地适应生存环境[4]。环状质粒有theta复制、滚环复制与链替换复制3种复制机制。过去观点认为,滚环复制的质粒更多出现在革兰阳性菌中,theta复制的质粒更多出现在革兰阴性菌中。随着测序和质粒提取技术的发展,在革兰阳性菌中不断发现theta复制的质粒。质粒的复制起点可决定其生物学特性[5-7]。质粒大小方面,滚环复制的质粒较小,theta复制的质粒较大;宿主范围方面,具有ColE1类质粒复制起点的质粒,其宿主范围较窄,具有RK2质粒复制起点的质粒,其宿主范围较宽;质粒的拷贝数受复制起点中串联重复序列的重复次数控制。Theta复制质粒的传统分类方法是参考Rep蛋白的氨基酸序列同源性分类[8],也可根据复制起点的共有序列,分为pUCL287[9]家族、pUCL22家族[10]等;但越来越多的theta复制质粒难以分类,如pLP60、pB21AG02等。目前最新的方法是根据复制机制进行分类[11]。本综述将依据最新分类方法,重点讨论theta复制A类质粒的研究进展,包括复制起点、Rep蛋白、复制机制、拷贝数调控及分类。