珍珠鸟和家鸡甲状旁腺激素3型受体(PTH3R)的结构与表达图谱分析

本研究采用RT-PCR方法,首先克隆珍珠鸟和家鸡的PTH3R基因全长cDNA序列.结果显示,家鸡PTH3R(cPTH3R)cDNA全长1632bp,编码543个氨基酸,珍珠鸟PTH3R(zPTH3R-w)cDNA序列全长1563bp,编码520个氨基酸,其蛋白均含有信号肽序列、七次跨膜区等特征性结构.此外,在珍珠鸟中还发现一个新剪接变体zPTH3R-v1,其cDNA序列全长1468bp,编码488个氨基酸,其缺失第3外显子进而导致第1跨膜结构域缺失.利用生物信息学方法,我们还对珍珠鸟和家鸡PTH3R蛋白序列进行三维建模.采用RT-PCR方法,本研究也对珍珠鸟PTH3R基因进行组织表达分析.结果显示,zPTH3R及其剪切变体zPTH3R-v1在珍珠鸟脑及外周组织中广泛表达.

家鸡卵泡刺激素受体新型剪接变体(FSHR-v)的克隆及功能探究

以家鸡为材料,利用RT-PCR技术,从家鸡卵巢中克隆了卵泡刺激素受体的一种新型剪接变体(cFSHR-v).基因结构与氨基酸序列比对分析表明,该剪接变体在8号外显子的5′端发生了差别剪切,导致了其相比于正常形式FSHR多出21个核苷酸,由此推测该变体(cFSHR-v)可以编码含有700个氨基酸残基的受体蛋白.与正常形式cFSHR相比较,cFSHR-v在N端胞外域增加了7个氨基酸残基.采用RT-PCR技术和pGL3-CRE荧光素酶报告系统,本研究也探究了cFSHR-v的功能及其在家鸡组织中的表达情况.结果显示,FSHR在家鸡卵巢及精巢组织中均有较高表达水平,但在CHO细胞中表达的cFSHR-v不能有效介导卵泡刺激素(FSH)对下游cAMP-PKA信号通路的刺激效应,说明在家鸡性腺中,FSHR存在剪切变体形式.

PTH单克隆抗体的制备与初步应用

甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)是一种只有84个氨基酸(amino acid,aa)的直链多肽激素,是调节钙磷代谢的主要激素之一。临床上通过测定PTH来评估骨转换、肾脏疾病以及血液透析患者的预后。本研究旨在通过制备抗PTH的单克隆抗体建立一种快速检测PTH的方法。首先,以化学合成法合成PTH多肽并将多肽偶联至血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)上,通过皮下注射的方式免疫BALB/c小鼠。其次,经过细胞融合以及杂交瘤细胞的筛选,共获得5株稳定分泌抗PTH的单克隆抗体,并对其进行了制备和纯化。再次,采用方阵棋盘滴定法进行抗体配对筛选,并以9B6和22E8抗体分别作为捕获抗体与酶标抗体,建立了检测PTH的双抗体夹心酶联免疫吸附测定(double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay,dsELISA)方法。最后,在保证灵敏度的情况下对所建立的方法进行了工作浓度的优化,该方法的检测灵敏度可达0.14ng/mL;在0.5~8.0 ng/mL的范围内,其R2达到了0.9858,有着较好的线性;其精密度在10%以下,保证了批间的稳定性。综上所述,本研究成功制备了抗PTH的单克隆抗体,建立了PTH的ELISA检测方法,该方法具有良好的线性相关性、准确度和精密度,可用于PTH含量的检测。