紫外交联免疫沉淀技术原理及其应用

紫外交联免疫沉淀(UV cross-linking immunoprecipitation,CLIP)技术最初建立于2003年。通过紫外交联、免疫沉淀、逆转录及后续的高通量测序等步骤,可在全转录组范围鉴定特定RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)的靶标RNA序列和结合位点。在近20年的应用过程中,该技术被不断改进和完善,可操作性、实验结果的准确性都有所提升,技术的应用范围也有所拓展。本文对CLIP技术的基本原理、实验方法、实际应用进行介绍,着重比较几种主流CLIP技术的异同,并对如何选择具体的技术路线提出建议。

DNA聚合酶η小分子抑制剂筛选

DNA损伤修复以及基因组稳定性维持对于动植物正常生长和防御逆境至关重要。针对DNA聚合酶错误掺入导致的基因组不稳定性,本研究以DNA聚合酶η为研究对象,通过计算分子模拟对接的方式,对其可能的小分子抑制剂进行筛选,并对其酶动力学参数进行测定。结果显示:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate,d ATP)对DNA聚合酶η的活性具有抑制效果,使其延伸的相对效率为36%~42%。分子模拟对接和体外实验结果表明,相较于dATP(亲和力为-26.7 kJ/mol),环鸟苷酸-腺苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP)与DNA聚合酶η具有更低的结合能(亲和力为-35.1 kJ/mol)。酶动力学参数测定结果也表明,相较于dATP,cGAMP具有更强的抑制能力且在浓度为0.5 mmol/L时达到最强(相对延伸效率为13%)。因此,本研究筛选获得了针对DNA聚合酶η的一种潜在的小分子抑制剂。同时,鉴于该蛋白质高表达导致细胞对抗肿瘤药物(DNA损伤剂)的耐受性,这为新型药物的开发提供了依据。

Aqp5-C末端截断小鼠的构建及其潜在应用

目的 Aqp5蛋白的C末端结构对其功能的发挥起着重要作用。本研究旨在通过构建Aqp5-C末端6个氨基酸缺失的突变小鼠,验证Aqp5-C末端6个氨基酸缺失对该蛋白亚细胞定位的影响,并初步比较研究此突变小鼠的肺脏组织结构和转录组的改变,探讨该突变小鼠用于Aqp5功能研究的潜在应用价值。方法 采用基于gRNA的CRISPER Cas 9技术构建Aqp5末端6个氨基酸缺失的突变小鼠(Aqp5-p.I260*)并进行序列鉴定,采用组织切片、荧光染色和显微镜观察等手段明确突变蛋白在肺泡上皮细胞的亚细胞定位和突变小鼠肺组织结构,采用转录组测序研究突变小鼠肺脏基因差异表达。结果 本研究成功构建了Aqp5蛋白C末端截断小鼠,发现p.I260*改变了亚细胞定位,Aqp5-p.I260*鼠肺泡数目少于野生鼠;Aqp5-p.I260*小鼠肺组织的转录组上调基因主要富集于发育和造血细胞谱系等通路,其Aqp5功能缺陷后诱发炎症相关通路基因(Hspa1a、IL-1β、Col3a1等)的表达水平改变。结论 本研究在体验证了小鼠Aqp5蛋白C末端6个氨基酸缺失突变对该蛋白细胞膜定位的关键作用,表明了以该小鼠作为Aqp5功能缺陷模型探讨Aqp5蛋白在肺发育和骨髓造血、炎症和免疫调节等生物学功能的潜在应用价值。

SWEET蛋白在植物生长发育中的功能作用研究进展

光合作用同化物分配供给是果实和种子发育的主要限制因子,增加蔗糖分配转运到果实和种子是增产优质的潜在策略。SWEET(sugar will eventually be exported transporter)是近年来被鉴定较多的一类糖转运蛋白,该蛋白质通过从源叶运输营养物质调控库组织发育,参与植物生长发育以及生物和非生物胁迫反应。SWEET蛋白定位于膜结构,属于MtN3家族,通常包含7个跨膜结构域,其中包含2个MtN3/saliva结构域。随着染色体加倍、片段复制和串联复制等,SWEET基因在物种中得到扩张。SWEET4和SWEET39基因是作物驯化改良过程中选择的关键基因;SWEET9蛋白是蜜腺特异性糖转运蛋白,参与植物蜜腺的进化;SWEET16和SWEET17蛋白参与植物根系生长发育;SWEET11和SWEET15蛋白参与植物种子胚乳填充。本文系统综述了SWEET蛋白的结构、数量、分类、亚细胞定位、成员扩张与进化,分析了SWEET蛋白在叶、茎、根系发育,花药发育,花蜜分泌,种子填充和果实发育等植物生长发育中的功能作用,强调了SWEET蛋白在作物改良中的应用,说明增强源库强度对作物产量提高的可持续性具有重要意义。

动物蛋白与植物蛋白对甜菜苷的热保护作用机制研究

为探究不同蛋白质对甜菜苷的热保护作用,明晰其保护机制,本文拟采用两种动物蛋白(乳铁蛋白和β-乳球蛋白)、两种植物蛋白(大米蛋白和大豆分离蛋白)为原料,采用浊度、紫外光谱、粒径、分子模拟等手段表征蛋白-甜菜苷复合物的形成和相互作用机制。结果表明,四种蛋白质均能提高甜菜苷的热稳定性,保护效果为:乳铁蛋白>大豆分离蛋白>β-乳球蛋白≈大米蛋白,蛋白质对甜菜苷热稳定性的提高与蛋白-甜菜苷复合物的形成有关。通过浊度、紫外光谱、粒径的实验结果推测,甜菜苷与乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大豆分离蛋白的结合程度高于大米蛋白,这可能是由于大米蛋白的低溶解度和紧密结构造成的。此外,相互作用和分子对接的结果显示,乳铁蛋白与甜菜苷主要通过氢键和静电相互作用结合,β-乳球蛋白与甜菜苷主要通过氢键发生相互作用,大米蛋白与甜菜苷主要通过疏水相互作用结合,大豆分离蛋白与甜菜苷主要通过氢键和静电相互作用结合。本研究为蛋白-天然色素的相互作用及甜菜苷的护色研究提供理论基础。

无脊椎动物脂肪酸结合蛋白的研究进展

脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding proteins,FABPs)是一类来自共同祖先基因的小分子蛋白,广泛存在于动物肠道、心脏、脑、脂肪和肌肉等多种组织中,能特异性结合脂肪酸并将脂肪酸输送到过氧化物酶体、线粒体和细胞核等细胞器中,进而调控脂肪酸氧化和甘油三酯及磷脂合成等脂代谢过程。文章通过综述FABPs的分类、结构特征、生物学功能及典型无脊椎动物(原生动物、节肢动物、软体动物和棘皮动物)FABPs的研究进展,发现无脊椎动物的FABPs分子结构缺少糖、水分子、氨基和巯基等官能团,其功能更具复杂性,且主要与生长发育及脂肪酸转运等相关。相对于脊椎动物,无脊椎动物的FABPs研究尚处于起步阶段,今后需要进一步探究其基因结构、蛋白构造及其生物学功能等,包括如FABPs作为脂肪酸的细胞内载体以确定无脊椎动物特定膜供体和受体位点的识别,阐明FABPs分子结构是否具有捕获或释放配体的构象能力,分析配体结合特异性应与β-桶折叠定义空腔表面涂层的理化特性关系,以及不同类型FABPs是否具有不同的结构特点及生物学功能等。此外,从无脊椎动物分离获得的某些FABPs对生物疫苗制备具有一定促进作用,因此可应用于水产动物育种和代谢性疾病防治等生产实践中,为当前集约化养殖模式下的生物营养代谢性疾病预防和治疗提供新的视角。

PD-L1降解途径与肿瘤免疫治疗

程序性死亡受体配体1(programmed death ligand 1,PD-L1)是肿瘤免疫检查点阻断治疗中的重要靶点,其在多种细胞中均有表达。肿瘤细胞可通过高表达PD-L1来增强程序性死亡受体1(programmed death 1,PD-1)抑制信号,从而促进肿瘤免疫逃逸。近年来,以抗PD-1/PD-L1抗体为代表的肿瘤免疫治疗给癌症治疗带来了革命性的变化。然而,肿瘤免疫治疗仅能对部分患者产生持久的疗效,多数患者对肿瘤免疫治疗的应答短暂或没有应答。研究发现,PD-L1的降解对肿瘤免疫治疗应答至关重要。本文综述了PD-L1的溶酶体降解途径、蛋白酶体降解途径及PD-L1降解与肿瘤免疫治疗的相互作用,旨在为进一步增强肿瘤免疫治疗的应答率和应答范围提供研究思路。

理化因素对川泽泻凝集素血细胞凝集活性的影响

[目的]明确温度、pH和金属离子等理化因素对川泽泻凝集素血细胞凝集生物学活性的影响。[方法]川泽泻块茎经研磨、浸取、硫酸铵沉淀、离子交换和亲和层析柱分离纯化得到凝集素(Alisma plantago-aquatica Linn.Lectin,APL),然后用系列温度、pH和金属离子等理化因素处理凝集素样品,应用倍比稀释法检测凝集素凝集人类血细胞活性。[结果]APL对家兔、家鸡、鲤鱼等动物血细胞无凝集作用,能使人ABO_(4)种类型血细胞发生不同程度凝集,对A型血细胞凝集活性明显高于其他3种血型红细胞。用20~100℃以10℃梯度处理后,川泽泻凝集素在20~40℃凝集活性很强,50℃凝集活性开始降低,在70℃仅具42%的凝集活性,80℃加热10 min完全失活;当pH为低于5.4或高于7.6时,凝集活性逐渐降低,当pH≤3.4或pH≥9.0时,川泽泻凝集素失去血细胞凝集活性;用EDTA透析后凝集素凝集活性基本消失,Ca^(2+)、Mg^(2+)、Mn^(2+)、K^(+)等离子能使凝集素凝集活性不同程度恢复。[结论]川泽泻凝集对热稳定性较弱;凝集活性最适pH为6.0~6.8,其凝集活性部分依赖于Ca^(2+)、Mg^(2+)等金属离子。

锌指蛋白调控肿瘤免疫原性的作用及其机制的研究进展

寻找对肿瘤免疫原性具有关键调控作用的生物治疗靶点是抑制肿瘤免疫逃逸、提高肿瘤免疫治疗效果的关键。锌指蛋白(ZFP)通过与DNA、RNA、蛋白质的相互作用,调控肿瘤抗原的形成、肿瘤表面MHC分子及其共刺激分子的表达、损伤相关分子模式的释放等,影响肿瘤细胞的免疫原性及肿瘤微环境(TME)中免疫细胞的分布和功能,进而在调节抗肿瘤免疫应答和肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。近年来,临床前及临床研究探索将ZFP相关的生物治疗方法应用于肿瘤免疫治疗,主要聚焦在免疫检查点阻断治疗、免疫细胞治疗,以及免疫治疗联合治疗策略展现出了可喜的应用前景。

金属硫蛋白

金属硫蛋白为一类广泛地存在于生物界的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白,尤其对Cd,Zn,Cu和Au,Ag等有较强的亲和力。它是一种诱导合成的蛋白质,在体内能被金属和糖皮质激素等所诱导。它具有广泛的生物学功能,主要是参与微量元素的储存、运输和代谢,拮抗电离辐射,清除羟基自由基和重金属解毒等多种作用。某些微量元素缺乏症等疾病也与它有一定关系。今后在某些疾病的治疗、环保中清除有毒金属以及采矿、富集贵重金属等方面有着广泛的应用前景。

乳铁蛋白肽(Lactoferricin)作用机制研究进展

近年来抗菌肽由于自身的优点成为抗生素的替代品 ,并已成为研究与开发的热点 ,其中乳铁蛋白肽因其强大的生物学功能而备受关注。就其结构、功能进行了综述 ,并根据其结构和生物学活性的关系探讨该肽的作用机制 ,同时也提出了乳铁蛋白肽研究中存在的一些问题及相应对策。

饥饿对小鼠脑中tau蛋白磷酸化和O-GlcNAc糖基化的影响

为了探讨大脑中葡萄糖摄取和代谢障碍在阿尔茨海默病(Alzheimer$sdisease,AD)神经退行性病变中的作用,将昆明种小鼠进行饥饿和再喂食处理,并使用多种磷酸化tau蛋白特异性的抗体和蛋白O-GlcNAc糖基化特异性抗体进行检测,观察饥饿及恢复喂养后不同时间点大脑皮质中tau蛋白糖基化及多个位点磷酸化的变化.结果显示:饥饿处理引起小鼠大脑皮质中总蛋白和tau蛋白的O-GlcNAc糖基化水平降低,同时tau蛋白磷酸化水平升高,饥饿引起的tauO-GlcNAc糖基化和磷酸化改变均在恢复进食后逆转成正常水平.该研究结果提示:大脑中tau蛋白的磷酸化和O-GlcNAc糖基化之间存在相互调节,脑中葡萄糖代谢障碍可能通过下调tau蛋白O-GlcNAc糖基化水平使tau蛋白产生异常过度磷酸化,进而促发AD的病理进程.这一结果为在早期阶段通过逆转tau蛋白异常过度磷酸化治疗AD成为可能提供了实验基础.

稀土探针Sm^(3+)与牛血清白蛋白结合作用的分子光谱及电化学表征

研究了稀土Sm3+ 与牛血清白蛋白 (BSA)固体配合物合成方法 ,对其傅里叶红外光谱分析表明 ,Sm3+ 与牛血清白蛋白的羟基的氧和胺基或酰胺基的氮形成强烈的配位配合物。紫外光谱分析表明 ,Sm3+ 与BSA作用时直接与酪氨酸残基作用。在模拟生理条件下研究了Sm3+ 与BSA的结合性质 ,荧光光谱分析表明Sm3+ 与BSA形成 2 5∶1的配合物 ,表观络合常数为lgK =11 0 0。并用循环伏安法研究了pH条件对Sm3+

金属硫蛋白的α、β结构域与铅结合形式及稳定性的研究

为研究金属硫蛋白与铅的相互作用 ,从基因工程菌 (BL2 1菌 )中分别提取并纯化结合了镉的金属硫蛋白α和β结构域 ,用酸解的方法脱去蛋白中的金属镉 ,然后用Sephadex G2 5纯化分别得到脱金属的α和 β结构域硫蛋白 (apo α MT和apo β MT)。在apo α MT和apo β MT中分别加入不同比例的铅 ,待反应完全后 ,用紫外吸收光谱法研究它们的巯基金属簇结构。经紫外吸收光谱图研究证明 :α结构域与铅反应可产生两种形式的结合物 ,一种为结合 4个铅的MT(Pb4 α MT) ,另一种则为结合 7个铅的MT(Pb7 α MT) ,而 β结构域与铅反应仅生成一种结合 3个铅的产物 (Pb3 β MT)。同时 ,通过与DTNB反应测定了它们的速率常数 ,结果表明结合了 4个铅的α结构域比另外两个产物的稳定性好。该研究对进一步探讨金属硫蛋白与铅反应的机理及其排铅功能提供了有力的证据。

金属硫蛋白清除羟自由基功能的研究

引言金属硫蛋白（Ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ，简称ＭＴ）是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。１９５７年Ｍａｒｇｏｓｈｅｓｅｔａｌ首次从马肾中分离出该蛋白，现发现ＭＴ几乎存在于所有生物体中。哺乳类动物的ＭＴ通常是一条６１个氨基酸的肽链，其中含有...

MALDI-TOF质谱技术研究铁蛋白蛋白壳表层的电荷分布

采用SephacrylS -300排阻层析和DEAE -纤维素层析技术分离纯化鱼工鱼肝铁蛋白 (LiverferritinofDasyatisAkajei,DALF)。纯化后的DALF经梯度聚丙烯酰胺凝胶再次分离后 ,显示出两条凝胶带 ,即单分子DALF和双聚态DALF。选用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱技术 (MALDI -TOFMS)研究DALF的电荷分布时 ,发现DALF蛋白壳表层上显示出三种不同质荷比的分子离子峰 ,其质荷比为10369.41m/z、20710.33m/z和41809.43m/z。当DALF亚基被解离后 ,这三个分子离子峰随之消失 ,因而推测DALF蛋白壳表层存在着高密度正电荷区域 ,并与该蛋白形成非电惰性有着密切联系。通过拟出DALF蛋白壳表面电荷分布模型 。

通心络胶囊对不稳定型心绞痛患者von Willebrand因子和纤维结合蛋白的影响

目的 观察通心络胶囊对不稳定型心绞痛患者 von Willebrand 因子(vWF)和纤维结合蛋白(Fn)水平的影响,并探讨其治疗机制。方法 60例不稳定型心绞痛(UAP)患者,随机分为常规组和通心络组,前者给予常规扩冠、抗血小板聚集治疗,后者在常规治疗基础上加用通心络胶囊4粒,每日3次,并于服药前后分别抽血测定血中vWF和Fn水平变化。结果 通心络组患者治疗后血中vWF和Fn水平明显回落,且通心络组总有效率明显高于常规组(P<O.05)。结论 通心络胶囊具有一定保护血管内皮、抑制血小板聚集作用。

维生素D受体最新研究进展

维生素D受体(vitam in D receptor,VDR)是一种核转录因子,通过与配体特异结合,调控多种基因的表达,从而调节多种生命活动的进行。本文总结了近年来VDR的研究进展,主要包括VDR的作用机制、VDR行使功能所需共激活子及共抑制子、VDR在生长分化、免疫调节和抑制肿瘤等方面的作用及VDR配体类似物在药物开发研究领域的最新进展。