苹果酸脱氢酶的结构及功能

苹果酸脱氢酶(MDH)可以催化苹果酸与草酰乙酸间的可逆转换,主要参与TCA循环、光合作用、C4循环等代谢途径。苹果酸脱氢酶可分为NAD-依赖性的MDH(NAD-MDH)和NADP-依赖性的MDH(NADP-MDH)。在所有真核生物和大部分细菌中,MDH通常形成同源二聚体,在少数细菌中为四聚体。不同来源的MDH催化机制和它们的动力学性质十分类似,显示了它们具有高度的结构相似性。MDH的功能多样,包括线粒体中的能量提供和植物的活性氧代谢等。回顾了苹果酸脱氢酶在生理学、医学、农学领域的研究进展,并针对其生化特性、空间结构特点、催化机理等生物学功能的分子生物学进展进行了综述。

人LDHA原核表达、纯化及体外抑制剂筛选模型的建立

在多数肿瘤细胞中高度表达的乳酸脱氢酶A(LDHA)与肿瘤的发生、发展和预后密切相关,筛选LDHA小分子抑制剂可提供一种富有潜力的靶向抗肿瘤策略.本研究以pET-28a为载体,构建了人LDHA表达质粒并于大肠杆菌BL21(DE3)中稳定表达,产量达到2.65mg/L.基于LDHA的催化反应建立了以丙酮酸钠和还原型烟酰胺腺嘌呤二核甘酸(NADH)为底物的筛选模型.实验结果表明:模型的LDHA最适质量浓度为60ng/mL,以质量分数0.25%草酸铵为阳性对照,筛选模型的Z因子为0.812.至此,本研究建立了LDHA抑制剂体外生化筛选模型,其成本低、可操作性强,符合高通量筛选要求,为发现新颖的LDHA抑制剂奠定了基础.

比色法测定大肠杆菌呼吸链脱氢酶活性

为了研究大肠杆菌在不同生理状态下的代谢活力,提出一种测定大肠杆菌内呼吸链脱氢酶的活力方法. 大肠杆菌细胞膜呼吸链中的脱氢酶将氯化碘硝基四氮唑(INT)还原为暗红色水不溶性物质,用有机溶剂提取暗红色物质并用比色法测定,得到脱氢酶的活力. 研究脱氢酶催化氯化碘硝基四氮唑的反应条件, 考察显色反应的各种影响因素.得到反应的最优条件为:检测波长为490nm, 测定的菌体质量浓度为0.1～0.4g/L细胞干重, INT质量分数为0.05%, pH7.2, 温度32 ℃. 结果表明,该测定方法能够正确地表达大肠杆菌细胞呼吸链脱氢酶活性,可用于研究多种因素对大肠杆菌代谢活力的影响.

植物NADP^+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的分子进化及功能研究进展

高等植物NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(ICDHs)定位于细胞质、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等植物细胞的不同部位,由不同的基因编码,属于一个高度保守的多同工酶蛋白家族。对近年来关于植物NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的分子进化及功能研究进行综述,同时提出了未来植物ICDHs的研究重点和方向。最新的分子系统学分析显示,植物中不同细胞定位的ICDH同工酶聚在各自相应的进化枝上,动物或植物中不同细胞器的ICDH同工酶均来源于各自祖先ICDH基因的独立倍增。最新的功能研究表明,ICDHs催化合成的α-酮戊二酸可为植物细胞对氨的吸收同化提供碳骨架,而NADPH可以维系细胞内的氧化还原平衡,帮助植物抵御氧化胁迫。

Nox和氧化应激与糖尿病

Nox(phagocyte-like NADPH oxidase)是吞噬细胞NADPH氧化酶催化亚基gp91phox的一系列同源物,广泛分布于体内多种非吞噬细胞.与NADPH氧化酶类似,Nox激活后可产生ROS,Nox产生的ROS是线粒体外ROS的主要来源.Nox产生的ROS,在控制新陈代谢,调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS),促使胰岛β细胞凋亡、胰岛功能障碍和糖尿病及其并发症的发生、发展中,发挥着重要作用.调节Nox的活性,改善机体内氧化应激水平,有望成为治疗糖尿病及其并发症的有效新途径.

转染人核糖核酸酶抑制因子对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

目的:利用脂质体转染技术上调乳腺癌MDA-MB-231细胞中核糖核酸酶抑制因子(ribonuc lease inh ib itor,R I)水平,探讨R I对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及细胞周期的影响。方法:采用脂质体转染法,将R I基因转入乳腺癌MDA-MB-231细胞,经G418筛选后获得稳定高表达R I的亚克隆细胞系MDA-MB-231/pLNCX-R I。RT-PCR、W estern-b lot等方法鉴定R I在转染细胞中的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长情况,流式细胞术检测细胞周期变化。结果:成功构建了稳定高表达R I的亚克隆细胞系MDA-MB-231/pLNCX-R I;MTT结果显示,转染的R I基因能抑制细胞恶性增殖(P<0.01);细胞周期分析显示转染的R I基因使细胞停留在G0/G1期,S期细胞明显减少(P<0.01)。结论:R I能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的恶性增殖。

乙醇对F_1-ATP酶和H^+-ATP酶的抑制与其核苷酸结合位点状态的关系

本文利用动力学方法研究了乙醇对F_1-ATP酶和H^(+)-ATP酶复合体的抑制与其结合核苷酸位点状态的关系,结果表明天然情况下乙醇对F_1呈现反竞争性抑制类型,对H^(+)-ATP酶呈现非竞争性抑制类型,且乙醇对F_1和H^(+)-ATP酶的抑制与核苷酸结合位点的构象密切相关。游离状态下和膜结合状态下的F_1在部分结合的核苷酸被洗脱前后动力学行为的不同,反映了二种状态下的F_1具有不同的构象,且F_0和膜脂对F_1起着一定的调控作用。

吡啶核苷酸转氢酶的结构及功能

吡啶核苷酸转氢酶(pyridine nucleotide transhydrogenases)是能直接催化NADP(H)与NAD(H)之间氢负离子可逆转移的氧化还原酶,主要调控分解代谢和合成代谢过程中NADH与NADPH之间的动态平衡.膜结合吡啶核苷酸转氢酶(TH)是ATP依赖性跨膜蛋白,由2个亚基构成,每个亚基包含dⅠ、dⅡ和dⅢ三个结构域.在TH结合可变催化机制中,氢负离子的转移总是与质子转移相偶联.可溶性吡啶核苷酸转氢酶(STH)是非能量依赖性的黄素蛋白,以可溶性多聚体形式存在.目前认为,很多因活性氧自由基异常增多而引起的线粒体疾病都与TH的活性有关,包括糖尿病、癌症、神经退行性疾病及心血管疾病等.TH分子机制的研究将有助于揭示这些线粒体疾病的致病机理以及为其诊断和基因治疗提供分子依据.STH作用机理的研究及其在辅酶再生系统中的应用,将会推动代谢工程和工业生物催化过程的进一步发展.

质粒抽提策略对双酶切鉴定的影响

目的探讨质粒抽提策略对质粒双酶切鉴定的影响。方法比较1.4 ml菌液单次抽提与分成两份0.7 ml和四份0.35 ml多次抽提的质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱质量。结果小体积菌液多次抽提的质粒纯度逐步提高(p ET-28a和p ET-28a-G6PD的OD260/OD280值分别为1.36和1.45,1.65和1.70,1.75和1.78);酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散逐步消失。结论控制菌液量对抽提高纯度质粒、获得理想的双酶切鉴定图谱至关重要。

甾体激素药物5α-雄烷二酮转化技术研究进展

5α-雄烷二酮(5α-androstane-3,17-dione)是生产美雄诺龙、美睾酮、美替诺龙等数十种甾体激素类药物的关键中间体,全球市场需求量大,高达20吨,产值约1亿元。论文主要从化学合成法、生物转化法介绍5α-雄烷二酮转化技术的特点以及发展趋势。采用化学合成法制备一般步骤较多,收率较低,成本较高且对环境污染严重;生物转化酶法仅通过一步完成,专一性强,收率高,对环境无污染,从而极大地降低生产能耗和成本,提升产品竞争力。

促生菌对黄瓜幼苗过氧化物酶活力的影响

分别在普通土和灭菌土中栽培黄瓜幼苗,用愈创木酚法测定其过氧化物酶活力。结果表明:普通土栽培的黄瓜幼苗,经促生菌处理后其过氧化物酶活力比对照组高3.81U,但没有达到显著性差异;无菌土栽培的黄瓜幼苗,经促生菌处理后其植株过氧化物酶活力比蒸馏水对照的低3.10U,且达到了显著性差异。

聚丙烯酰胺凝胶上SDH的活染

精心选择了电泳系统及活染条件,得到较清晰的活染结果.从活染胶板上发现玉米叶SDH 存在两种形式,而根部只有一种形式.可能在叶及根部都存在的那种SDH

人烯醇化酶1在原核细胞中的可溶性表达及纯化

目的用原核表达系统生产人烯醇化酶1(ENO1),为筛选抑制剂奠定基础。方法通过5′分别带Nde I和Xho I位点的一对引物PCR扩增ENO1 cDNA,用Nde I+Xho I酶切cDNA和质粒pET-28a。酶切产物经纯化后用T4 DNA ligase连接,并转化大肠杆菌Top10,用含卡那霉素的LB平板(LBK培养基)筛选转化子。提取转化子质粒,酶切和测序法鉴定。将序列正确的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),用LBK培养基培养抗性菌落至OD_(600)约为0.7,加入终浓度0.2mmol/L IPTG,16℃诱导ENO1表达20h。超声破碎收集的菌体离心取上清,用组氨酸标签蛋白(可溶性)纯化试剂盒纯化ENO1。对纯化的ENO1进行超滤浓缩和缓冲液交换后,BCA法测定浓度,低温保存。结果ENO1正确连入pET-28a,重组菌pET-28a-ENO1-BL21(DE3)经0.2mmol/L IPTG诱导后,从裂解液上清中获得了高纯度的ENO1,产量达427mg/L。结论高产量、高纯度可溶性ENO1奠定了抑制剂筛选模型建立的基础。

过氧化氢酶在琼脂糖膜中的电化学研究

用琼脂糖(Agarose)将过氧化氢酶(Cat)固定在热裂解石墨电极表面,制备了Cat agarose膜修饰电极。包埋在琼脂糖中的过氧化氢酶可以与电极直接传递电子,在pH6.0的磷酸缓冲溶液中可得一对可逆的过氧化氢酶辅基血红素Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)氧化还原峰,式电势为-0.343V(vs.SCE)。其式电势随溶液的pH值增加而负移且呈线性关系,直线斜率为-36.8mV/pH,说明过氧化氢酶的电子传递过程伴随有质子的转移。紫外可见光谱、红外光谱表明,在琼脂糖膜中过氧化氢酶的构象保持不变。并研究了过氧化氢酶修饰电极对氧气、过氧化氢、一氧化氮的电催化性质。在16.5～278μmol/L的范围内,催化电流与过氧化氢浓度呈线性关系;在2.75～20.76mmol/L的范围内,催化电流与亚硝酸根浓度呈线性关系。

亚硫酸盐还原酶发酵工艺条件初探

本文对硫酸盐还原菌产亚硫酸盐还原酶的发酵工艺条件进行了初步研究,主要内容包括硫酸盐还原菌发酵条件: 碳源、氮源、温度、起始pH、装液量及发酵周期等。实验研究表明,以尿素作为氮源,以可溶性淀粉为碳源,C:N比为1: 3,在初始pH7．0的条件下,接种量为5％。装液量为1:3(v／v),35℃摇床培养42h,酶活力可达到16．2U／mL。

枯草芽孢杆菌胞外二氢硫辛酰胺脱氢酶的纯化

采用弱阴离子树脂DEAE-52和蓝色琼脂糖凝胶FF层析对枯草芽孢杆菌产生的胞外二氢硫辛酰胺脱氢酶的粗酶液进行2步纯化,得到电泳纯的二氢硫辛酰胺脱氢酶,纯化倍数为59.7,收率为46.9%。通过SDS-PAGE法测得其亚基分子质量为64.6 ku,Superdex 75法测得其分子质量为67.5 ku,表明枯草芽孢杆菌WY34产胞外二氢硫辛酰胺脱氢酶为单亚基蛋白质。本研究采用的二氢硫辛酰胺脱氢酶的纯化方法,简便且收率较高。

与NADPH氧化酶相关的植物抗病性研究进展

综述了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶及其催化产生的活性氧在植物抗病过程中的作用。

乳酸脱氢酶同工酶在大鼠不同发育阶段中变化的研究

以大鼠为材料，用垂直管型聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）同工酶图谱的组织特异性及其在不同发育阶段中的变化。实验结果表明，不同组织有其特异性的ＬＤＨ图谱，这种组织特异性，反映了在不同组织细胞中Ａ基因和Ｂ基因转录过程和转录后调节的差异性，同时还表明同一组织在不同发育阶段有各具特色的ＬＤＨ电泳图谱。如在骨骼肌组织中，老年与幼年鼠比较，５种同工酶含量均有显著性差异。同工酶的这种变动，在个体发育过程中，可能有十分重要的生理意义。

人LDHB的原核表达及体外抑制剂筛选模型的建立

目的建立人乳酸脱氢酶B(LDHB)体外抑制剂筛选模型。方法用一对5'端分别带NdeⅠ、XhoⅠ位点的引物扩增LDHB cDNA。LDHB cDNA经NdeⅠ+XhoⅠ双酶切后与同样酶切的pET-28a质粒连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α。将筛选的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.2 mmol/L IPTG诱导LDHB表达,镍离子亲和层析柱纯化LDHB。以丙酮酸钠和NADH为底物,通过检测340 nm波长处光密度值的变化,确定LDHB及其抑制剂棉酚的最适浓度,并计算模型的Z因子。结果 LDHB的表达量为25 mg/L,LDHB、棉酚的最适浓度分别为22.5μg/L、10μmol/L,筛选模型的Z因子为0.91。结论建立了成本低、可靠性强、适合高通量的LDHB体外抑制剂筛选模型。

短乳杆菌产NADH氧化酶的发酵及纯化

有氧环境下,利用优化后的发酵培养基,研究短乳杆菌(Lactobacillus brevis)产NADH氧化酶(NOX)的发酵条件.采用8层纱布,在温度为30℃,pH=7.0,转速为150 r.min-1的条件下发酵培养23 h,用pH值为5.8的0.1 mol.L-1磷酸钾缓冲液对细胞进行洗涤悬浮,超声波破碎(功率为400 W,超声2 s,间歇2 s,破碎12 min)后,测得其比活力可达2.317 mkat.g-1.通过DEAE Sepharose Fast Flow,Macro-Prep High Q和Hydroxyapatite-Ⅰ三步纯化后,其纯化倍数为3.11,回收率为8.50%.