固氮酶催化作用机理及其化学模拟

固氮酶是某些微生物在常温常压下固氮成氨的主要催化剂 ,其催化机理和化学模拟是国际上长期致力研究的对象 .尽管人们已经揭示了固氮酶催化活性中心铁钼辅基 (Fe Mo- co) Mo Fe7S9(R-高柠檬酸 )的结构 ,然而 ,有关 Fe Mo- co生物合成的详细途径和其中包含的钼铁转移和利用 ;固氮酶在哪些活性位和按什么模式结合 N2 ,C2 H2 、CO等多种底物或抑制剂 ;以及其中涉及的电子和质子传递过程等许多问题 ,至今尚有待解决 .本文将综述这些问题的研究进展和厦门大学固氮组最近五年来的相关研究工作 .

超氧化物歧化酶模拟化合物的生物活性研究

根据天然超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性部位结构合成了含苯并咪唑的５种配体及其３２种分别含Ｃｕ（Ⅱ）、Ｆｅ（Ⅲ）、Ｍｎ（Ⅱ）、Ｃｏ（Ⅱ）的模拟化合物经光谱、电化学测试证明这些化合物具有拟Ｓ３Ｄ活性，其５０％抑制率浓度（ＩＣ５０）为１０－６～１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１。

硫酸铵与盐酸胍对鸡肝二氢叶酸还原酶的激活和失活作用

在５℃、２０℃、３０℃，鸡肝二氢叶酸还原酶的活力随盐酸孤浓度增加，先经历一个激活区，以后则为失活区。温度升高，使最大激活幅度变小，激活区变窄，所需盐酸孤浓度减小。硫酸铵在浓度低于０．２ｍｏｌ／Ｌ时，对天然酶有较小的激活作用，更高浓度的硫酸按使酶活力下降；胍激活酶的活力随硫酸铵浓度的增加，由天然酶的２１０％单调下降；对失活酶，增加硫酸铵的浓度，则使酶活力逐渐恢复；三种情形的终活力均为天然酶的４０％。相应条件下的荧光光谱和圆二色谱的结果表明，硫酸铵对天然酶与激活酶的构象影响不大，但可使失活酶的构象恢复到与天然酶相似的状态。

乳酸脱氨酶DAB－环己烷反胶束溶液中的活性

研究了兔肌乳酸脱氢酶Ｍ４（ＬＤＨ）在十二胺丁酸盐（ＤＡＢ）－环己反烷胶束溶液中的催化活性。发现ＬＤＨ在ＤＡＢ反胶束中的催化转换数（Ｋｃａｔ）同水溶液中的相近。ＬＤＨ在ＤＡＢ反胶束中的活性随增溶水量的增加而增加，随ＤＡＢ浓度的增加而降低，文中还提出了ＬＤＨ在ＤＡＮ反胶束中的增溶方式。

超氧化物歧化酶全酶和脱辅基酶胍变性时失活与去折叠的比较研究

利用紫外差吸收光谱和荧光发射光谱等监测手段研究天然铜锌ＳＯＤ（ｈｏｌｏ－ＳＯＤ）和脱铜锌ＳＯＤ（ａｐｏ－ＳＯＤ）在不同浓度胍溶液中的去折叠及活力变化．结果表明ｈｏｌｏ－ＳＯＤ和ａｐｏ－ＳＯＤ分别在４．０和２．０ｍｏｌ／Ｌ胍溶液中去折叠，而分别在２．０和０．５ｍｏｌ／Ｌ胍溶液中其构象尚未发生明显改变时活性几乎完全丧失．提示金属离子对维持酶的整体及活性部位构象具有重要作用，脱去金属离子的酶分子的构象特别是活性部位的构象更易受到变性剂的破坏．

光谱技术研究固氮酶铁硫簇的理化特性

Ｎ－甲基甲酰胺碱度是提取高质量固氮酶铁钼辅基的关键因素之一。过量的亚甲蓝能氧化并分解铁铜铺基为含双相铁硫簇和铁硫簇固氮酶铁钼辅基和在紫外可见光谱区中均无特征吸收峰，而在３２０ｎｍ处却呈弱吸收峰，棕色固氮菌固氮酶和该菌的突变菌侏ＵＷ４５固氮酶（缺铁钼辅基）中的非含钼的铁硫簇在紫外可见光谱区３２０ｎｍ和４０５ｎｍ处均含有特征吸收峰．

酰化人红细胞超氧化物歧化酶稳定性的研究

用月桂酸对人红细胞超氧化物歧化酶（ｈ－ＳＯＤ）进行化学修饰得到酰化ｈ－ＳＯＤ（Ａｃ－ｈＳＯＤ），并对Ａｃ－ｈＳＯＤ和ｈ－ＳＯＤ的稳定性进行了比较。结果表明：Ａｃ－ｈＳＯＤ活力为ｈ－ＳＯＤ的７２％。比活力为４０００Ｕ／ｍｇ，Ａｃ－ｈＳＯＤ的热稳定性、酸碱稳定性及抗蛋白酶水解能力均比天然酶提高。

固氮酶铁钼辅基理化特性的研究

在紫外可见光谱区内，固氮酶铁钼辅基〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（１２）Ｓ_（１２））４－〕均无特征吸收峰，不含高柠檬酸盐。含双钼的铁硫簇〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（６～１２）Ｓ_（６～１２））^（１～４）－〕的电荷数、颜色与该金属簇中的亚铁量成对应关系，并都有较高的生物重组活性．

大鼠20α羟类固醇脱氢酶在大肠杆菌中的表达

利用谷胱甘肽Ｓ－转移酶（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）融合基因表达系统，大鼠２０α羟类固醇脱氢酶（２０αＨｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄＤｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，２０αＨＳＤ）在大肠杆菌中得以成功地表达。亲和层析和Ｔｈｒｏｍｂｉｎ消化，可从融合蛋白中回收和纯化重组２０αＨＳＤＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法和酶活性测定显示，重组２０αＨＳＤ具有天然蛋白质相同分子量、相似的抗原性和酶催化活性，其对ＮＡＤＰ的Ｋ＿ｍ值和Ｖ＿（ｍａｘ）分别为９．５μｍｏｌ／Ｌ、３３４ｎｍｏ１／（ｍｉｎ·ｍｇ），对底物２０α羟孕酮（２０αＨｙｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ，２０αＯＨＰ）的Ｋ＿ｍ值和Ｖ＿（ｍａｘ）分别为５．９μｍｏｌ／Ｌ和３４７ｎｍｏｌ／（ｍｉｎ·ｍｇ），利用该表达系统大量制备大鼠重组２０αＨＳＤ，为深入研究２０αＨＳＤ的生理活性和功能创造条件。

超氧化物歧化酶切割超螺旋DNA的活性

在体外系统中 ,发现超氧化物歧化酶 (SOD)具有切割超螺旋DNA的活性 .猪血和牛血Cu/Zn SOD以及烟草Mn SOD都能将超螺旋DNA转变为非超螺旋结构的缺刻环状DNA ,进一步产生线状DNA .它们只作用于超螺旋DNA而不作用于线状DNA .这个事实排除了SOD样品中污染核酸酶的可能性 .用H2 O2 、胍基抑制或蛋白酶降解的实验结果表明 。

铜锌超氧物歧化酶对几种羟自由基产生系统的影响

应用脱氧核糖降解法研究了ＣｕＺｎ－ＳＯＤ对几种·ＯＨ产生系统的作用机理．结果证明：ＳＯＤ对Ｆｅ（３＋）·Ｏ·Ｈ２Ｏ２系统中·ＯＨ的产生有明显的抑制作用，而失活ＳＯＤ或ＢＳＡ对它的抑制作用不大；在Ｆｅ（２＋）·Ｈ２Ｏ２和ＣＵ（２＋）·Ｈ２Ｏ２系统中，ＳＯＤ、失活ＳＯＤ和ＢＡＳ均能抑制·ＯＨ的产生；在Ｆｅ（２＋）·Ｏ系统中，ＳＯＤ对·ＯＨ产生作用不大，而失活ＳＯＤ或ＢＳＡ对它有明显的抑制作用．由此推测ＳＯＤ对·ＯＨ形成可能有三方面的影响：１．对Ｏ的清除作用，阻断Ｈａｂｅｒ－Ｗｅｉｓｓ反应；２．对金属离子的络合作用，降低·ＯＨ的产额；３．促进Ｈ２Ｏ２的积累，加快Ｆｅｎｔｏｎ反应．

静电作用与修饰铜锌超氧化物歧化酶的稳定性

铜锌超氧化物歧化酶（Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ）表面的赖氨酸经化学修饰后，酶的稳定性显著提高．赖氨酸被修饰后，酶的电荷结构遂发生变化，从而影响到酶分子电场．使用ＦＤＰＢ方法（有限差分法求解Ｐｏｉｓｓｉｏｎ－ＢＯｌｔｚｍａｎ方程）计算了酶修饰前后的静电场变化，以及对维持酶的结构稳定起重要作用的Ｃｕ，Ｚｎ配位结构的影响结果表明，Ｃｕ，Ｚｎ配位体的两级离解常数在酶修饰后分别约下降１０３，１０６．

丙酮酸脱氢酶分形性质的光散射研究

生物大分子的分形性质与其三维结构、柔性、疏水性，进而与活性有重要关系。本文采用动态与静态光散射技术测量了丙酮酸脱氢酶的分维ｄｆ，讨论了上述两种光散射方法测量分维各自适用的范围。

光谱、波谱法研究铜锌超氧歧化酶与氯化钴(Ⅱ)、组氨酸钴(Ⅱ)相互作用

我们首次发现的铜锌超氧歧化酶（Ｃｕ２Ｚｎ２ＳＯＤ）与氨基酸等发生直接相互作用的现象，是一种前人未研究过的重要的生化新现象［１］。在此新发现的基础上，本文用ＩＣＰ，ＶＩＳ，ＮＭＲ和酶活性测定等方法，又从不同角度拓展研究了Ｃｕ２Ｚｎ２ＳＯＤ酶与两类不同化合物，即无机氯化钴（ＣｏＣｌ２）、有机组氨酸钴（Ｃｏ（Ⅱ）（Ｈｉｓ）ｎ）的直接相互作用，发现酶活性中心金属离子同样与外加的这两类不同化合物发生相互作用，相应地影响了酶的催化活性。还发现Ｃｏ（Ⅱ）（Ｈｉｓ）ｎ比ＣｏＣｌ２与酶相互作用更强、更快，Ｃｏ（Ⅱ）（Ｈｉｓ）ｎ中的Ｃｏ（Ⅱ）更易进入酶中，更影响了酶的催化活性。

中华仓鼠二氢叶酸还原酶的酶学性质研究

测定中华仓鼠二氢叶酸还原酶（ＤＨＦＲ，Ｅ．Ｃ．１．５．１．３．）催化反应的各个动力学常数，对其反应机制进行了研究。测定了不同浓度脲溶液中酶与底物的解离常数Ｋｄ和表观米氏常数Ｋｍ，结果表明酶与底物二氢叶酸（ＤＨＦ）和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ＮＡＤＰＨ）的结合能力相差很小，都随脲浓度增加而减弱，而且一种底物的结合会削弱酶与另一底物的结合能力。研究了ＤＨＦＲ在脲变性过程中活力和构象的变化，结果表明低浓度脲可使稳态酶活力增强，此时酶的内源荧光发射光谱和ＣＤ谱变化很小；随脲浓度的增加，酶逐渐失活，同时荧光光谱的最大发射峰位红移，荧光强度和椭圆率也明显下降，说明酶活力的变化先于酶分子整体构象的变化，酶活性部位位于比酶分子整体更易受变性剂影响的有限区域。

固氮酶中的电子传递

提出改进的二步ＡＴＰ驱动的电子传递机理，对还原剂和ＭｇＡＴＰ都充足或其中有一种不充足的情况下固氮酶体系的ＥＰＲ信号变化作了合理的解释．

牛肝L-谷氨酸脱氢酶在压力下的解离

运用荧光光谱方法研究了牛肝Ｌ－谷氨酸脱氢酶（ＧＤＨ）在压力下的解离。研究表明，在２ｋｂａｒ时ＧＤＨ由六聚体解离成亚基，标准解离体积变化为－２９３ｍｌ／ｍｏｌ，解离自由能为４８ｋｃａｌ／ｍｏｌ（１０℃）。ＧＤＨ在压力下的解离还显示出异常的浓度依赖性，表明在天然寡聚蛋白的布居中存在着自由能不同的单体聚合。不同温度下的ＧＤＨ解离研究结果表明，由亚基－六聚体的聚合是一熵增驱动过程。ｂｉｓ－ＡＮＳ存在时观察到的现象，暗示谷氨酸脱氢酶的亚基解离过程中发生了构象漂移（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｄｒｉｆｔ）。

酪氨酸酶在有机介质中的酶活性

研究了蘑菇酪氨酸酶在有机溶剂中催化邻苯二酚向邻苯醌的转化反应，结果表明酪氨酸酶在有机介质中能保持较高的活性，其活性主要受体系中的水活度控制。在适当控制酶分子上结合水的条件下，酶活性随温度升高而增大。无机盐的水合物可用于控制这种低水有机介质中的水活度。