ω-转氨酶的筛选和异源表达用于制备S-甲氧基异丙胺

根据转氨酶家族进化分类和底物特异性,构建一个包含36个ω-转氨酶的酶库;将酶库中的基因克隆进大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中进行异源重组表达,考察酶蛋白表达水平并测定相应的酶活以及对映体选择性。通过筛选,获得最佳的ω-转氨酶为来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的ω-转氨酶BmeTA,其重组表达粗酶活为2.0 U/mL,纯酶比活为9.5 U/mg蛋白;酶学性质表征发现其最适温度为35℃,最适pH为8.0。在此基础上进一步优化其催化反应工艺条件,在20 g/L加酶量、0.5 mmol/L辅酶添加量以及1.4的氨基供体/氨基受体比例条件下,反应18 h获得450 mmol/L的S-甲氧基异丙胺,原料转化率达到90%,为实现生物催化制备S-甲氧基异丙胺的工业化奠定基础。

谷胱甘肽硫转移酶基因表达的调控

催化内源性或外源性亲电子化合物与谷胱甘肽 (GSH)结合的谷胱甘肽硫转移酶 (GST)超基因家族是一族解毒功能蛋白 .其基因的表达通过不同的机制受多种物质的调控 .根据最近文献资料 ,对调控谷胱甘肽硫转移酶基因表达的基因结构。

献血者筛查ALT活性标准研究分析

目的 探讨分析ALT活性作为献血者检测标准及其参考区间。方法 选择从未受血和HBV、HCV标志物均为阴性的 2 84 9名健康人和献血者作为研究对象 ,采用连续监测技术测定其血清ALT活性 ,又在其中随机选取 6 85名以赖氏法测定ALT活性。结果 血清ALT的测定值在各年龄组无显著性差异 ;男性ALT活性明显高于女性 ,具有明显的统计学差异 (连续监测法 :Ρ<0 .0 0 1 ;赖氏法 :Ρ<0 .0 5 )。ALT活性连续监测法测定 x± 2s上限为 5 3 4 9U/L , x± 3s限为 6 6 .5 9U/L ;ALT活性赖氏法测定 x± 2s上限为 2 4 96U , x± 3s上限为 38 89U。结论 参照赖氏法参考区间 ,ALT连续监测法参考区间上限应该为 5 3.4 9U/L。

血站丙氨酸氨基转移酶检验中几种诊断方法的比较

目的 探讨献血者血清丙氨酸氨基转移酶最佳筛查试验方法。方法 对几种血清丙氧酸基转移酶定值样本、非定值样本、标准质控血清作速率法与赖氏法检验比较、使用酶标仪与全自动生化分析仪的检测结果比较、诊断试剂的比较。结果 ①速率法与赖氏法比较 :在检验准确性方面 ,速率法较赖氏法的符合率要高约 10个百分点 ;在检验精密度方面 ,速率法较赖氏法的变异系数 (CV )要低约 10个百分点。两组符合率t检验和两组精密度t检验显示 ,差异皆有非常显著性意义 ;②使用酶标仪与全自动生化分析仪的检测结果比较 :均值 ( x)t检验和 CVt检验显示 ,差异皆无显著性意义 ;③诊断试剂的比较 :速率法试剂检验结果 x方差分析显示 ,3种试剂 (2种国产、1种进口试剂 )之间 ,差异没有显著性意义 ;CV方差分析显示 ,3种试剂之间 ,差异有非常显著性意义 ,经q检验显示 ,国产试剂与进口试剂之间 ,差异有显著性意义。 3种赖氏法试剂检验结果 x和CV方差分析显示 ,3种国产试剂之间 ,差异皆无显著性意义。微孔板速率法试剂与微孔板丙酮酸氧化酶法试剂在批内精密度方面没有显著差异 ,但在与贝克曼试剂的相关性方面及对定值质控样品检测的准确性方面 ,微孔板速率法试剂优于微孔板丙酮酸氧化酶法试剂。

小麦尿卟啉原合酶的分离和纯化

以40%～70%饱和度硫酸铵分级沉淀、DEAESepharoseiCL-6B、SephadexG-100、羟基磷灰石、PhenylSepharoseCL-4B和制备电泳分离纯化了小麦的尿卟啉原合酶(UROS)。酶的亚基分子质量为54ku,全酶分子质量为66ku,酶的等电点6.3,在pH8.2时比活为257μmol/(mg·min),最适反应温度40℃,5mmol/L的巯基乙醇和Mg2+促进酶活,纯化的小麦UROS在-20℃下0.1mol/L,pH8.5的Tris-HCl,内含质量分数为50%的甘油,5mmol/L的巯基乙醇和MgCl2中贮藏7d酶活损失90%。

转谷氨酰胺酶产生菌的筛选和鉴定

主要介绍了转谷氨酰胺酶产生菌的筛选以及菌种的鉴定。用稀释涂布方法进行初筛以期得到链轮丝菌 ,再通过 N-苄酯基 - L-谷氨酰甘氨酸比色法确定此菌是否产转谷氨酰胺酶。然后根据其在不同培养基上的培养特征以及生理生化特征来进行产酶菌的菌种鉴定。

免疫抑制法检测m-AST及其应用

目的探讨天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶(m-AST)测定的方法及其临床应用。方法用免疫抑制法抑制胞浆AST(c-AST),再直接测定m-AST,并比较不同病人的数据。结果m-AST可用自动化分析仪直接检测,在一定的范围内具有良好的线性关系,病例组与对照组比较有显著差异(P<0.05)。结论该方法简便、快速,适用于全自动生化分析仪,对临床诊断具有一定的价值。

水产动物中一氧化氮合酶的研究概况

近年来发现 ,由一氧化氮合酶催化产生的一氧化氮参与机体的多种生理功能。NADPH 黄递酶染色法和免疫组化方法研究发现 ,生物体内广泛存在一氧化氮合酶。本文参阅了国内外资料 ,对一氧化氮及一氧化氮合酶的作用、合成、结构及组织分布进行了概括 ,重点对一氧化氮合酶在水产动物中研究进行了综述。

猪肾γ-谷氨酸基转移酶(GGT)的提纯及其稳定性

目的 提纯活性稳定的GGT，制备用于GGT（测定的参考品。方法 用差速离心法从猪肾皮质中分离刷状缘微绒毛膜，用 Triton X－100溶解膜结合的酶，用抗GGT亲和层析柱提纯 GGT，检测提纯品的有关特性。结果 提纯品GGT比活600IU/mg蛋白，得率45.5%，未测出临床常测的酶，在不同方法间的活性比与人血清GGT相似，在特定介质中制成冻干品，经加速变性试验，在-20℃和4℃预期年失活率分别为0．02％和0．25％。结论 本法提纯GGTT速度快，得率高，几乎不含杂酶，稳定性好，在不同方法间与人血清酶有互换性，是用于制备酶参考品提纯GGT的理想方法。

5种浓度水平冰冻混合人血清ALT、AST二级标准品的研制

目的研制5个浓度水平冰冻混合人血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)二级标准品,为常规检测ALT、AST提供稳定性和互通性良好的准确度验证材料和校准品。方法收集无脂血、溶血的含ALT和AST的5个浓度水平的混合人血清,滤菌后分装于冻存管中,(-70±2)℃保存。采用单因素方差分析检验该标准品的均匀性,并观察其在15～25℃(室温)、2～8℃和-70℃的稳定性。4家实验室采用国际临床化学联合会(IFCC)推荐的含和不含磷酸吡哆醛(PLP)参考方法对标准物质定值,并评定不确定度。观察血清物质在7种进口配套检测系统的互通性,并用直线回归分析进行评价。结果血清物质均匀性良好(P>0.05),稳定性在15～25℃和2～8℃时能满足使用要求,-70℃保存至少稳定1年。4家实验室对该标准品的定值结果具有一致性,总体不确定度较小。血清物质的互通性良好,仅浓度4和5在含PLP的方法间互通性稍差。结论研制的5水平冰冻混合人血清均匀性、稳定性、互通性良好,定值准确,可用作ALT、AST的二级标准品。

两种采血流程ALT检测结果的比较与分析

目的 比较不同采血流程ALT检测结果不合格情况 ,寻求更佳的采血流程。方法 汇总本站 1 998～2 0 0 0年 8月 1 2 4 36 3人次的无偿献血采血及检验记录 ,分析先采后检 (先经快速检测ALT合格后采血 ,再作 2次全项检测 ) ,先检后采 (对献血者血液小样全项检测合格后采血 ,再全项复检 )两种采血流程的检测结果及其不合格原因中ALT所占的比例。结果 不合格率 ,先采后检组为 4 8% (4 880 /1 0 1 1 70 ) ,先检后采组为 1 7% (399/2 31 93) ,二者差异有显著性意义 (P <0 0 1 ) ,但两组ALT在不合格原因中所占比例差异无显著性意义 (P >0 0 1 )。结论 在初筛时宜同时快速检测ALT ,合格者立即采血可减少献血不合格率。

ALT作为血液质量判断指标的评价

目的:评价丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)作为血液质量判断指标的价值。方法:对经过初筛合格且ALT>40U/L的标本使用ELISA方法检测HBsAg、抗-HCV,利用核酸扩增检测技术(nucleic Acid amplification tech-niques,NAT)对标本进行HBV-DNA和HCV-RNA的检测。结果:3 675份无偿献血者标本中有397份(10.80%)ALT>40U/L。在这397份标本中有389份(97.99%)的HBsAg和抗-HCV定性均阴性、HBV-DNA和HCV-RNA定量均呈现低拷贝数。而另8份(2.01%)标本的HBV-DNA或HCV-RNA呈现高拷贝数,其中3份标本HBsAg定性阳性、HBV-DNA呈现高拷贝数;4份标本抗-HCV定性阳性、HCV-RNA呈现高拷贝数;1份标本HBV-DNA呈现高拷贝数,HBsAg和抗-HCV定性阴性。结论:ALT作为判断血液质量的指标将造成大量血液资源的浪费。采用NAT作为判断血液质量指标,既能保证血液质量,又能保证血液不浪费。

营养因素对哺乳动物成纤维细胞谷胱甘肽S—转移酶的影响

体外培养幼年仓鼠肾成纤维细胞(BHK—21/C13)发现,谷胱甘肽S—转移酶(GST)的活性受多种因素的修饰。在含10％胎牛血清(FCS)的培养基中培养72.96和120h,该酶的相对活性分别为84％、100％和131％;在96h换新鲜培养液,并继续培养24h,酶的活性相当于未换培养液组的75％;培养基中FCS的含量降低50％、酶的活性升高一倍。进一步研究抗氧化性营养物质对GST活力的影响发现:维生素E(14μmol/L)使此酶活性稍有降低,但不显著;微量元素硒(0.1μmol/L)则使该酶的活力降低22％。用马来酸二乙酯(DEM)耗竭70％谷胱甘肽(GSH),酶的活性升高33％。推论:GST的活力可望成为营养不良,甚或慢性氧化应激的定量评价指标之一。

丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备特异性抗人丙氨酸氨基转移酶(ALT)单克隆抗体(McAb)并鉴定其特性。方法用纯化的ALT抗原(20μg/次)免疫BALB/C小鼠5只,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(按细胞数5∶1比例)融合,采用间接ELISA筛选杂交瘤细胞,阳性孔经3次有限稀释法克隆。用ELISA检测腹水及上清的抗体效价和相对亲和力,用Western blotting检测McAb的特异性,用秋水仙素阻断法进行染色体分析。结果得到1株杂交瘤细胞株(7D1),其染色体数目为95—106,其分泌的抗体为IgG1,轻链为κ型;上清和腹水抗体效价分别为10-4和10-6;SDS-PAGE显示该抗体在55和25 kD附近各有1条带,与预计的分子量大小一致。纯化抗体的亲和常数为2.2×1011。PAGE后Western blot检测显示该McAb可与人血清中的ALT结合。结论所制备的杂交瘤细胞株能分泌抗人ALT的特异性McAb。