磷酸化修饰介导的病原微生物致病机制研究

病原微生物通过特殊的分泌系统向宿主释放一系列效应蛋白,干扰宿主的先天免疫相关信号通路,引起疾病的发生甚至导致宿主死亡,是病原微生物致病的重要手段。翻译后修饰在病原微生物感染过程中发挥重要功能,受到越来越多重视,其中,磷酸化修饰是一种常见的翻译后修饰,迄今为止许多效应蛋白被发现具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。微生物借助于这些具有激酶活性的效应蛋白,将宿主内特异靶蛋白进行磷酸化修饰,进而干扰宿主细胞内的信号转导功能,抑制宿主免疫防御反应,促进病原微生物在宿主体内的繁殖与扩增。对近期发现的具有激酶活性的效应蛋白进行概述,为进一步理解磷酸化修饰介导的病原微生物感染以及药物靶标选择提供参考。

E1A激活基因阻遏子促进人血管平滑肌细胞分化和迁移

为探讨E1A激活基因阻遏子(cellularrepressorofE1A-stimulatedgenes,CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞株HITASY分化和迁移中的调控作用,构建了重组逆转录病毒载体pLNCX2(+)/CREG和pLXSN(-)/CREG.以带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的空载体pLNCX(+)/GFP和正常HITASY为对照,用磷酸钙共沉淀法将重组逆转录病毒载体转染293细胞,包装出完整的逆转录病毒后,感染HITASY.经G418筛选,获得稳定感染的细胞克隆.应用免疫荧光染色、蛋白质印迹等方法检测CREG和平滑肌分化标志蛋白α-肌动蛋白(SMα-actin)表达,同时通过刮伤实验、慢速显微摄像技术检测细胞迁移能力以及用明胶酶谱方法分析细胞基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)的活性.结果表明:pLNCX2(+)/CREG稳定感染的HITASY中CREG和SMα-actin蛋白表达上调,MMP-2和MMP-9活性升高,细胞迁移速度加快;pLXSN(-)/CREG稳定感染的HITASY中CREG和SMα-actin蛋白表达下调,MMP-2和MMP-9活性降低,细胞迁移速度减慢.上述研究提示CREG在诱导血管平滑肌细胞分化的同时促进细胞迁移.

RhoA和血清反应因子(SRF)介导E1A激活基因阻遏子诱导人血管平滑肌细胞分化

为探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)对人血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的调控机制,应用重组逆转录病毒表达载体pLNCX2(+)/CREG及pLXSN(-)/CREG制备稳定感染HITASY细胞模型,观察CREG蛋白过表达及表达抑制对人VSMCs分化的影响并探讨其调控机制.结果显示:pLNCX2(+)/CREG稳定感染细胞呈分化表型,细胞细长变成组织样聚集生长趋势,细胞中CREG蛋白和平滑肌分化标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(SMα-actin)表达显著增加,同时SMα-actin相关调控因子——血清反应因子(SRF)入核转位,RhoA总蛋白表达上调,以Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用后,CREG诱导的SMα-actin表达下调的同时SRF出核转位;pLXSN(-)/CREG稳定感染的细胞体积变大,细胞极性消失,呈无序生长,细胞中CREG和SMα-actin蛋白表达显著降低,同时伴有SRF出核转位及RhoA总蛋白表达下调.免疫共沉淀分析发现,CREG蛋白能被分泌到VSMCs培养基中表达,并可与细胞膜受体6-磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子Ⅱ型受体(M6P/IGF2R)发生直接相互作用.用蛋白磷酸酶PP2A特异性抑制剂okadaicacid减少M6P/IGF2R在细胞膜表面分布,可明显抑制CREG过表达引起的RhoA、SRF和SMα-actin表达.上述结果提示,在体外培养的人VSMCs中,CREG可能作为一种分泌型蛋白质通过与细胞膜受体M6P/IGF2R相互作用,依次激活SMα-actin蛋白相关调控因子RhoA和SRF引起SMα-actin表达增加,促进VSMCs向分化表型转换.

国外纳豆激酶的开发现状

概述了目前国内外开发纳豆激酶的现状 ,应用情况和市场动态 ,供研究开发者参阅。

电针镇痛的累积效应与大鼠下丘脑、海马蛋白激酶A表达变化的观察

目的:观察电针(EA)"足三里"-"阳陵泉"镇痛的累积效应,及大鼠下丘脑和海马细胞蛋白激酶A(PKA)活性的变化。方法:Wistar雌鼠68只,随机分为正常对照组、慢性压迫损伤(CCI)组、CCI+EA 2天(d)组、CCI+EA 2周(w)组、去卵巢(OVX)+CCI组、OVX+CCI+EA 2 d组、OVX+CCI+EA 2 w组。Morris水迷宫法检查OVX+D-半乳糖皮下注射动物的学习记忆能力。结扎坐骨神经造成CCI慢性痛模型,电针双侧"足三里"-"阳陵泉"穴(2/15 Hz,1~2 mA,1次/d)。用辐射热照射大鼠双侧足底引起的缩腿反应潜伏期(PWL)的差值作为痛敏分数(HS)判断动物的痛反应;用免疫组化法检测下丘脑和海马组织PKA的活性。结果:CCI术后,与正常组比较,各组HS都明显升高。在单纯CCI动物上,与CCI组比,CCI术后第18天CCI+EA 2 d、CCI+EA 2 w的HS显著减小(P<0.05);CCI+EA 2 w组的HS显著低于CCI+EA 2 d组(P<0.05)。在记忆损害的动物上,OVX+CCI+EA 2 w和OVX+CCI+EA 2 d组HS明显低于OVX+CCI组(P<0.05);而两EA组间HS差异没有显著性意义(P>0.05)。CCI+EA 2 w组下丘脑室旁核(PVN)、弓状核(ARC)和视上核(SON)区PKA的灰度值均明显低于正常对照组(P<0.05),PVN和ARC区也显著低于CCI+EA 2 d组(P<0.05);OVX+CCI+EA 2 w组PVN和SON区的PKA灰度值亦均明显低于OVX+CCI组(P<0.05)。说明EA 2 w可上调PKA的表达,且具有累积性作用。OVX+CCI+EA 2 w组ARC和SON区PKA的灰度值均显著高于CCI+EA 2 w组(P<0.05),提示EA上调PKA表达的累积效应在记忆功能减退的动物上明显减弱。海马PKA的表达与SON等下丘脑核团PKA的表达趋势类似。结论:电针镇痛有累积作用,其累积效应可能与下丘脑、海马细胞PKA的表达上调有关,并且与动物神经记忆有密切关系。

电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠受损神经元细胞外信号调节蛋白激酶的影响

目的:探索电针对脑缺血再灌注大鼠大脑受损神经元的保护作用及其细胞外信号转导机制。方法:随机将24只SD大鼠均分为假手术组、模型组、电针组和电针+PD98059组,采用改良Longa线栓法复制局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型。电针组取"百会""大椎"穴,选用疏密波,频率80～100Hz,电流强度1～3mA,电压1～3V,持续电刺激60min。电针+PD98059组于腰椎间隙注入丝裂原活化蛋白激酶1的抑制剂PD980592.78mg/kg,并电针。依据Julio氏神经行为学评分法对各组大鼠进行评分,采用免疫组织化学染色法观察电针及PD98059阻滞状态下电针对模型大鼠右侧病灶处颞叶大脑皮层锥体细胞层细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)蛋白表达的影响。结果:电针能改善模型大鼠的神经行为学分值(P<0.01),上调脑缺血再灌注大鼠受损神经元ERK的蛋白表达(P<0.01),其作用可被PD98059阻断(P<0.01)。结论:电针可减轻脑缺血再灌注大鼠大脑神经元的损伤,促进损伤修复,这一作用可能与其影响缺血再灌注后ERK信号通路的变化有关。

磷酸化的蛋白激酶p44/42MAPK在成年大鼠脑内的分布

目的 研究活化形式的 p44 / 42 MAPK在成年正常大鼠脑内的分布。 方法 免疫组织化学方法(ABC法 )。 结果 磷酸化的 p44 / 42 MAPK在正常大鼠脑内有广泛的表达 ,出现在许多核团 ,特别是在岛皮质、感觉运动及视、听皮质、扣带前皮质、海马尾侧的内嗅区、内侧杏仁核、皮质杏仁核和中介核、视上核、视交叉上核、A14区、下丘脑室旁核大细胞部、弓状核、前腹侧视前核、下丘脑后区、顶盖前区、室周灰质腹外侧柱、蓝斑、臂旁外侧核、小脑 Purkinje细胞、A5区、旁巨细胞外侧核、吻侧 (C1区 )和尾侧 (A1区 )延髓腹外侧网状结构等。阳性结构主要见于神经元的胞浆、胞核和突起内 ,在部分脑膜细胞和少突胶质细胞内也有表达。 结论 活化的 p44 / 42 MAPK在脑内的广泛存在提示其作为重要的信号转导分子在正常状态下的脑功能活动中可能起重要作用。

纳豆激酶分离纯化及纤溶活性研究

经过生理盐水浸提、(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析等纯化步骤,从纳豆中获得层析纯的纳豆激酶,纯化倍数15.6,回收率10.2%,SDS-PAGE电泳显示为二个组分,分子量在29000左右。对其纤溶性质研究表明:纳豆激酶活性的最适pH为8.0,pH6～10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆生理盐水浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。

毒死蜱对土壤蔗糖酶活性的影响

采用模拟方法探讨了毒死蜱污染土壤酶活性的变化规律。结果表明,有机质含量高的土壤,毒死蜱对土壤蔗糖酶具有明显的抑制作用,在酸性和中性条件下,酶活性的抑制幅度较大,在试验所设的培养时间内,毒死蜱对蔗糖酶活性的抑制总的变化趋势呈现先激活后抑制。建议对于有机质含量较高的土壤,采用蔗糖酶活性作为表征土壤毒死蜱污染程度的监测指标。

甲羟戊酸激酶基因研究进展

类异戊二烯是维持生物生长发育等所必需的重要有机物质,包括甾醇、长萜醇、辅酶Q、叶绿素和生长调节剂等多种重要物质,是通过甲羟戊酸代谢途径的一系列酶酶促反应合成的。综述了该途径中的限速酶之一甲羟戊酸激酶的生物学特性、基因克隆及表达等方面的研究进展,旨在为其病虫害控制、动植物改良中的应用提供依据。

一种具有纤溶活性的蛋白酶的分离纯化及性质

目的分离纯化BacillussubtilisJin2 1发酵产生的具有纤溶活性的蛋白酶 ,并对其性质进行研究。方法通过硫酸铵分级盐析 ,SerineSepharose 2B和SephacrylS— 2 0 0色谱柱进行分离纯化 ,用SDS PAGE测定纯度 ,SDS PAGE和凝胶层析测定相对分子质量 ,纤维蛋白平板法测定酶活力。结果分离得到了电泳纯的酶 ,该酶的相对分子质量为 2 8kD ,等电点约为 8 6 ,最适 pH为 7 5 ,最适温度为 4 0℃ ,在 4 0℃以下较稳定 ,超过 5 0℃时酶活力开始下降 ;金属离子Mn2 + 对酶有明显的激活作用 ,而Zn2 + 对酶有抑制作用 ,二异丙基磷酰氟 (DFP)和苯甲基磺酰氟 (PMSF)完全抑制酶活性。结论该酶是一种丝氨酸蛋白酶 ,与纳豆激酶相似 。

E1A激活基因阻遏子(CREG)过表达通过抑制p38/JNK信号分子活化对抗人血管平滑肌细胞凋亡

血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡参与了动脉粥样硬化(AS)及冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄(RS)等心血管疾病的发生发展过程.E1A激活基因阻遏子(CREG)是新近发现的一种分泌型糖蛋白,在维持细胞和组织稳态方面发挥重要作用.前期研究发现CREG蛋白过表达能够对抗血清饥饿诱导的人血管平滑肌细胞(hVSMCs)凋亡,进一步探讨CREG对hVSMCs凋亡的调控作用及相关的分子机制.以逆转录病毒稳定转染的CREG过表达及表达抑制的hVSMCs为模型,应用两种药物Staurosporine(STS)和Etoposide(VP-16)诱导细胞发生凋亡,检测细胞凋亡和相关信号通路变化.结果显示,在药物干预后,CREG表达抑制时细胞凋亡明显增多,而CREG过表达明显抑制hVSMCs凋亡.同时也发现,CREG表达抑制时p38及JNK活性明显增强,而CREG过表达时p38和JNK活性被抑制.经腺病毒转染和药物干预抑制p38表达后,细胞凋亡均受到抑制,而且在p38活性被抑制的同时,JNK活化也受到抑制.说明p38和JNK表现为协同作用.结果也显示,VSMCs分化指标SMα-actin和SM MHC与CREG表达呈一致趋势,而细胞外基质蛋白Fibronection与CREG表达呈负相关.以上结果提示,CREG在维持VSMCs表型转换方面发挥重要作用,并且通过p38和JNK信号转导通路对hVSMCs凋亡进行调控.CREG可能对于AS和PCI术后RS的防治具有重要价值.

p42/44MAPK对PGF_(2α)所致大鼠子宫平滑肌收缩中Connexin43表达的介导

为探讨 p4 2 / 4 4促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) -间隙连接蛋白 4 3(Cx4 3)信号途径与 PGF2α致大鼠子宫平滑肌收缩的关系 ,采用 RT- PCR技术检测 Cx4 3m RNA表达水平 ,采用 western- blot方法检测 Cx4 3蛋白表达水平。结果表明 :PGF2α增强子宫平滑肌收缩时 ,伴有 Cx4 3m RNA和蛋白表达水平增高 ;PD980 5 9(MEK1抑制剂 )部分抑制PGF2α致大鼠子宫平滑肌的收缩 ,同时还可抑制 PGF2α所致的 Cx4 3m RNA和蛋白表达水平的增高。提示 :p4 2 / 4 4 MAPK-Cx4 3信号途径参与

蛋白激酶B及其在磷脂酰肌醇3-激酶介导的信号转导中的作用

蛋白激酶B(PKB)是原癌基因c akt的表达产物 ,它参与由生长因子激活的经磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI3K)介导的信号转导过程。与许多蛋白激酶相似 ,PKB分子具有一特殊的AH/PH结构域 (AH/PHdomain) ,后者能介导信号分子间的相互作用。PKB是PI3K直接的靶蛋白。PI3K产生的脂类第二信使PI 3,4, P2 和PI 3,4,5 P3等均能与PKB和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 (PDK)的AH/PH结构域结合 ,使二者转位于质膜上并活化。PDK也能使PKB磷酸化而激活 ,激活的PKB又进一步激活抗细胞凋亡机制、葡萄糖代谢 (糖原合成、糖酵解及葡萄糖的摄取 )及蛋白质合成等过程 。

纳豆激酶基因导入番茄的研究

将来源于枯草芽孢杆菌的纳豆激酶(nattokinase,NK)基因转化到人类可以直接食用的,又非常喜爱的蔬菜—番茄中,得到在转录水平表达的转基因植株.通过根癌农杆菌EHA105介导,转化番茄的下胚轴,诱导愈伤组织形成及分化成幼苗,进而再生出完整植株.提取再生植株基因组DNA,通过PCR扩增检测,结果表明纳豆激酶基因已经成功整合到番茄植物基因组中.RT-PCR实验结果证明了纳豆激酶基因在转录水平上有表达.

肌酸激酶结构与功能研究进展

目的综述肌酸激酶的结构与功能研究进展以及应用。方法根据近年来的文献 ,介绍了肌酸激酶的结构、在不同条件下伴随构象变化其功能的改变机制、生理功能的研究进展以及实际应用。结果肌酸激酶是研究蛋白质体内折叠的机制的理想模型 ,已经取得了突破性的进展 ,为生物大分子的结构与功能理论提供了依据。肌酸激酶具有重要的生理功能 ,目前在临床如肿瘤检测方面已有广泛的应用。结论对肌酸激酶的结构与功能的研究 ,将会广泛地应用于临床诊断、新药研究等方面。

重组人CK2β亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶CK2 β亚基cDNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下表达 .表达蛋白大多数以不溶形式存在 .6L (约 10 2g)表达菌抽提得到约 2 0mg的可溶性表达产物 ,通过P11磷酸纤维素一步层析分离 ,得到 6 8mg纯化蛋白 .SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化的蛋白为一分子质量2 6ku的单一蛋白带 .蛋白质印迹结果证明 :纯化的表达产物与抗人CK2 β抗体可发生特异性免疫反应 .CK2 β亚基对CK2α有激活作用 ,纯化的CK2α和β亚基在等摩尔混合时即可组成有最大生物活性的全酶 .实验结果有力地证明了克隆表达与纯化的重组蛋白是人蛋白激酶CK2 β亚基 .

极光(aurora)激酶在细胞有丝分裂和肿瘤形成中的重要功能

极光激酶(aurora kinases)是负责调控细胞有丝分裂的一类重要的丝氨酸/苏氨酸激酶。在不同的模式生物中,极光激酶各家族成员的结构和功能部高度保守。近年来,随着极光激酶相关研究的不断深入,人们逐渐认识到极光激酶在细胞有丝分裂以及肿瘤形成中的重要功能。在细胞有丝分裂中, 极光激酶参与了诸如中心体成熟分离、纺锤体组装和维持、染色体分离以及胞质分裂等多个事件。异常表达的极光激酶往往会导致细胞在有丝分裂的过程中出现大量的异常现象。此外,极光激酶还参与了肿瘤形成的过程,已经发现一些靶向作用十极光的小分子具有显著的抑癌作用。本文围绕哺乳动物的三种极光激酶,重点讨论了它们在细胞有丝分裂中的动态定位、生物学功能以及时空上的调节方式, 并分析了异常表达的极光激酶参与肿瘤形成的可能途径,提出了肿瘤治疗的新思路。

3,6-二羟黄酮对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析

目的观察3,6二羟黄酮对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制,寻找CK2的抑制剂。方法以重组人CK2全酶为分子靶点,检测不同浓度3,6二羟黄酮对CK2活性的影响,并通过酶的动力学分析其抑制作用机制。CK2活性通过测定转移到CK2底物上的[γ32P]ATP的[32P]放射活度来检测。结果重组人CK2与天然CK2的性质完全一致。3,6二羟黄酮对重组人CK2全酶具有较强的抑制作用,IC50为1393μmol·L-1;进一步分析,它与ATP呈竞争性抑制CK2的活性,抑制常数Ki值为1067μmol·L-1;与酪蛋白呈以非竞争性为主的混合性抑制CK2的活性,抑制常数Ki值为1734μmol·L-1。结论3,6二羟黄酮是一种重组人蛋白激酶CK2的抑制剂。重组人CK2可作为一种较为简便地筛选和开发有效的CK2抑制剂的分子靶点。