苛求芽孢杆菌胞外尿酸酶的表征及其在血清尿酸测定中的应用

目的考察苛求芽孢杆菌（ATCC 26904）分泌型尿酸酶的特性和将其应用于直接动力学尿酸酶法测定血清尿酸的有效性。方法苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶经DEAE-cellulose层析纯化后，用于以积分法分析尿酸酶反应曲线预测反应体系本底的直接动力学尿酸酶法测定血清尿酸。结果苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶只含1种肽链，分子量为34．7kD（1kD=0．9921ku），其米氏常数为（0．22±0．01）mmol／L（n=11），黄嘌呤抑制常数为（36±3）μmol／L（n=4）。用此尿酸酶，只要被分析反应曲线终点的底物浓度低于起点的30％，应用积分法就能可靠预测本底；直接测定反应前吸收，可使直接动力学尿酸酶法不受常见血清成分、酶活性变化和15μmol／L黄嘌呤等干扰。监测0．025U／ml尿酸酶反应5min的数据，其线性响应范围为1～50μmol／L；所得临床标本血清尿酸含量（Ct）与过氧化物酶偶联间接终点平衡法（Ce）正相关（Ck=-0．008＋1．046Ce，r=0．996，n=206），但Bland—Altman法分析表明两种方法不一致。结论苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶可用于直接动力学尿酸酶法测定尿酸，并可保障其优势。

甲硫氨酸合酶与神经管畸形

近年研究表明同型半胱氨酸蓄积是患神经管畸形和心血管疾病的危险因素之一。甲硫氨酸合酶是同型半胱氨酸代谢的关键酶 ,其活性缺失可能会导致同型半胱氨酸蓄积及甲硫氨酸缺陷。本文综述了甲硫氨酸合酶基因突变与神经管畸形的流行病学研究结果 ,目前尚未证实甲硫氨酸合酶与同型半胱氨酸蓄积以及神经管畸形发生的关系 。

分析谷胱甘肽-S-转硫酶的产物抑制反应过程测定还原型谷胱甘肽

目的以谷胱甘肽-S-转硫酶(GST)为模型,探讨有产物抑制时用积分法分析酶反应过程测定底物量的可靠性。方法从猪肝制备GST。1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)终浓度为1.0 mmol/L,监测GST催化还原型谷胱甘肽(GSH)与CDNB结合产物在340 nm吸收变化。用积分法预测反应终点的产物吸收。结果优化产物抑制常数可使此积分法所得反应终点产物吸收对剩余底物变化不敏感。此积分法测定GSH对常见干扰有抗性。此法测定大鼠肝匀浆中外加GSH回收率大于98%,线性响应上限接近90μmol/L,下限接近2.0μmol/L,所得大鼠肝GSH含量与文献报道一致。结论有产物抑制时用积分法也可定量底物;用此积分法进行动力学酶法分析具有一定普遍性,而且有明显优势。

果蝇硫化氢合成相关基因在不同虫态的转录水平

构建了23个物种的甲硫氨酸腺苷转移酶、甘氨酸N甲基转移酶、胱硫醚β合成酶和胱硫醚γ裂解酶的氨基酸序列的系统进化树,进化分析表明这4类蛋白均具有基本一致的系统进化关系,并且均被归为昆虫和哺乳动物两大类群。通过实时荧光定量PCR方法分析了黑腹果蝇不同发育阶段编码甲硫氨酸腺苷转移酶、甘氨酸N甲基转移酶、胱硫醚β合成酶和胱硫醚γ裂解酶的M(2)21AB、CG6188、CG1753和Eip55E基因的mRNA水平。结果显示:M(2)21AB基因mRNA水平在各发育阶段间无显著差异;CG6188基因mRNA的表达量在卵期较低,到了幼虫期显著升高,尤其在2龄幼虫期达到最高,而在蛹期和成虫期明显下降;CG1753基因mRNA的表达量在幼虫期明显上升,至蛹期达到最高水平,而在成虫期又显著降低;Eip55E基因mRNA水平在幼虫期、蛹期及成虫期均比卵期显著提高。以上结果表明,内源性H2S在黑腹果蝇中具有重要的生理学功能。

谷胱甘肽硫转移酶结构与功能研究进展

谷胱甘肽转硫酶(G lutath ione S-transferases,简称GSTs,EC2.5.1.18)是广泛分布于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、寄生虫及微生物体内的一组多功能同工酶,其主要功能是催化某些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联,增加其疏水性使其易于穿越细胞膜,分解后排出体外,从而达到解毒的目的.着重介绍了近年来谷胱甘肽硫转移酶结构与功能研究的进展,详细描述并比较了多种同工酶的三级结构、生化功能、催化机制以及底物特异性,同时对GSTs种类之间结构与功能的进化做了较深入探讨.

大鼠谷胱甘肽S-转移酶P1基因顺式调控元件的搜寻

目的搜寻大鼠谷胱甘肽Ｓ－转移酶Ｐ１基因（ｒａｔｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓ－ｆｅｒａｓｅＰ１，ｒＧＳＴＰ１）上游３．０ｋｂ区域内顺式调控元件。方法采用高灵敏度的荧光素酶报告基因载体，以外切酶Ⅲ（ＥｘｏⅢ）、Ｓ１核酸酶对上述３．０ｋｂ片段进行删切后造成缺失，将所获得的一系列缺失质粒分别转染ＨｅＬａ细胞，测定转染细胞裂解液荧光素酶活性。结果当删切从－２．９ｋｂ进展至－２．３ｋｂ时，荧光素酶活性降低６７％（Ｐ＜０．０５），－２．５ｋｂ～－２．２ｋｂ区域能以不依赖于位置、方向性的方式增强基因表达强度，从－１．８ｋｂ缺失到－１．３ｋｂ时，荧光素酶活性升高４倍（Ｐ＜０．０５）。结论ｒＧＳＴＰ１基因上游在－２．５ｋｂ～－２．２ｋｂ及－１．８ｋｂ～－１．３ｋｂ区域内分别存在增强子元件和负调控序列。

谷胱甘肽S-转移酶及其在妇科恶性肿瘤的研究

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是一组具有多种生理功能的二聚体蛋白质,可催化谷胱甘肽向亲电子化合物转移产生结合物,具有抗诱变和抗肿瘤的作用,并与化疗耐药有关。近年研究表明,GST在多种人体恶性肿瘤中表达增强,如肝癌、肺癌、胆管癌、食管癌、胃肠道癌等。本文就其在妇科恶性肿瘤的研究进展综述如下。

兔羟类固醇磺基转移酶AST-RB_2的分子克隆、表达和酶学特性

胞质磺基转移酶至少有三个基因家族组成 ,最近纯化到的一个兔羟类固醇磺基转移酶 AST- RB2 ( ST2 A8) ,对羟类固醇和胺类表现出很高的催化活性。为了鉴别此酶 ,兔的 c DNA文库用抗 AST- RB2 抗体筛选阳性克隆。根据纯化的 AST- RB2 氨基酸序列 ,可判定筛选的 c DNA克隆为编码 AST- RB2 的基因。克隆的 c DNA与其它哺乳动物的羟类固醇磺基转移酶 ( ST2 )在氨基酸水平有较高的同源性 ( 5 8%～ 6 8% ) ,但与芳香磺基转移酶 ( ST1 )的同源性较低 ( <37% )。在大肠杆菌中表达的蛋白质可催化典型的 ST2 底物硫酸化 ,根据 ST2 A8的基本结构及底物特异性可判定其属于 ST2 家族。在大肠杆菌中表达的 ST2 A8的细胞定位 (胞质 /不溶性片段 )也与鼠 ST2 A1和 ST2 A2有明显的不同。ST2 A8对石胆酸没有催化活性 ,但对脱氧表雄酮和睾酮却表现出极高的催化活性 ,由此表明 ST2 A各型 ( ST2 A1 ,ST2 A2、ST2 A3、ST2 A8)的内源性底物特异性有明显差异。

在高于米氏常数的底物浓度下用积分法测定尿酸酶活性

目的 :以尿酸酶为模型 ,考察在底物浓度高于酶米氏常数 (Km)时用积分法测定酶活性 (Vm)的可靠性 .方法 :用 2 93nm光吸收记录尿酸酶反应曲线 .用以反应时间为自变量的积分速度方程 ,以尿酸酶Km 为常数而本底为非线性参数拟合尿酸酶反应曲线 ,搜寻对应最好拟合的Vm.结果 :此积分法测定Vm 主要受剩余底物浓度影响 ,本底基本没有干扰 .剩余底物低于 2 .5 μmol/L时用 1 0～ 70 μmol/L起始底物所得Vm 无差异 .用 2 5和 70 μmol/L起始底物浓度时初速度和Vm 都与酶量呈正比 .在此两种底物浓度下积分法的下限相同 ,且与初速度法下限无明显差异 .但用积分法测定酶活性的上限明显高于初速度法 ,而且起始底物浓度越低则差异越显著 .结论 :在积分法中使用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线 ,在高于Km

融合标签谷胱甘肽S-转硫酶高亲和配体的设计与筛选

目的:设计与筛选融合标签血吸虫谷胱甘肽S-转硫酶(Glutathione S-transferase,GST)的高亲和配体。方法:将原核融合表达载体pGST-MOLUC转入大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷低温诱导GST标签表达,用Glutathione Sepharose 4B亲和纯化此标签GST。初速度法测定GST对底物1-氯-2,4-二硝基苯(1-chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)和还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的Km;测定GST产物S-(2,4-二硝基苯基)-谷胱甘肽(GS-DNB)、3,5-二甲基苯甲酸、对丁基苯甲酸、依他尼酸及3者对应的对称双酰丁二胺对标签GST的抑制作用。结果:纯化标签GST对GSH和CDNB顺序结合且Km都高于0.10mmol/L;GS-DNB相对CDNB的竞争性抑制常数约5μmol/L,相对GSH的非竞争性抑制常数约33μmol/L。3,5-二甲基苯甲酸、对丁基苯甲酸、依他尼酸对此GST抑制常数都大于0.20 mmol/L;N,N’-双依他尼酰-1,4-丁二胺和N,N’-双对丁基苯甲酰-1,4-丁二胺都为GST相对GSH的强竞争性抑制,抑制常数分别为31 nmol/L和(0.61±0.43)μmol/L(n=3)。结论:将标签GST低亲和力芳香羧酸用柔性短链连成对称结构,可获得结合于单个活性中心的高亲和力标签GST抑制剂。

用线性动力学方法考察黄嘌呤对尿酸酶的抑制作用

目的:以米氏常数相差较大的两种尿酸酶为模型,考察用两个底物浓度下标定比活性确定酶动力学参数和筛选抑制剂的可靠性.方法:用293nm吸收监测尿酸酶反应.通过两个底物浓度下标定比活性确定表观米氏常数(apparentmichaelismentenconstant,Kmapp)和表观最大反应速度(apparentmaximalreactionrate,Vmapp).据表观动力学参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inhibitionconstant,Ki).结果:只要所用尿酸浓度中较小者(thelowerconcentrationofuricacid,SL)大于待测Km的0.8倍且较大者(thehigherconcentrationofuricacid,SH)在SL的1.4倍以上,此线性动力学法能可靠测定Bacillusfastidiosus和Candidaspecies尿酸酶的米氏常数,且与双倒数法结果一致.如SL大于Km的3.8倍而SH为SL的3倍,此线性动力学法所得Candidaspecies尿酸酶Kmapp与抑制剂浓度成正比,Ki为(4.8±0.5)μmol/L,与双倒数法结果一致.Bacillusfastidiosus尿酸酶Km太高,底物浓度有限时不能用此方法筛选其抑制剂.结论:此线性动力学方法仅用高于Km的底物浓度也能可靠确定酶动力学参数,有利于用常规定量方法筛选对底物具有高亲合力特殊靶酶的抑制剂.

用积分法考察黄嘌呤对Candida species尿酸酶的抑制作用

目的:以Candida species尿酸酶为模型,考察用积分法筛选抑制剂的条件.方法:用293 nm吸收记录尿酸酶反应.用反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线确定表观米氏常数(apparentM ichaelis-M enten constant,Km app)和表观最大反应速度(apparentm axim al reaction rate,Vm app).据上述参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inh i-b ition constant,Ki).结果:被分析数据中的畸异值显著降低结果可靠性.通常终点底物<1/6Km app而起始底物足够高,此积分法测定Km app的偏差和变异低于20%而Vm app精度更高.用积分法所得Km app与双倒数法一致,且和黄嘌呤浓度成正比,对应Ki为(5.4±0.8)μmol/L(n=3),也与双倒数法一致.结论:被分析数据精度足够高,用无抑制剂时米氏常数(M ichaelis-M enten constant,Km)4倍以上的起始底物浓度并固定终点底物浓度<1/6Km,此积分法能用于筛选特殊类型的抑制剂.

两种依他尼酸衍生物对人类谷胱甘肽-S-转移酶Mu的抑制动力学研究

目的:考察所设计依他尼酰乙胺、双依他尼酰丁二胺及对应产物对人类谷胱甘肽-S-转移酶Mu(glutathione-S-transferase Mu,GSTM)的抑制动力学。方法:重组表达GSTM,以2,4-二硝基氯苯(1-chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)为底物,跟踪酶反应过程的紫外吸收变化,测定酶活性。比较GSTM存在下依他尼酰乙胺、双依他尼酰丁二胺与GSH孵育前后对酶的半抑制浓度(IC50)、抑制类型。结果:依他尼酰乙胺、双依他尼酰丁二胺对GSTM的IC50分别为(44.0±2.2)μmol/L、(0.090±0.012)μmol/L(n=3),两者相对GSH是反竞争性抑制剂、相对CDNB是竞争性抑制剂。与酶和GSH孵育原位生成产物后,对GSTM的IC50分别为(8.9±0.1)μmol/L和(0.006±0.001)μmol/L(n=3);依他尼酰乙胺与GSH孵育后相对GSH是竞争性抑制剂、相对CDNB是混合型抑制剂;双依他尼酰丁二胺与GSH孵育后相对GSH和CDNB均为混合型抑制剂。两种依他尼酸衍生物与GSH孵育后产物IC50明显降低,双依他尼酰丁二胺及其GSH孵育产物IC50较依他尼酰乙胺及其产物均明显降低。结论:依他尼酰乙胺、双依他尼酰丁二胺是潜抑制剂,其产物对GSTM的抑制作用更强,抑制类型发生明显改变;双依他尼酰丁二胺及其产物较依他尼酰乙胺抑制作用更强。

用质粒pUC18在大肠杆菌中表达人蛋白质二硫键异构酶

用质粒ｐＵＣ１８在大肠杆菌中表达人蛋白质二硫键异构酶高音，王志珍（中国科学院生物物理研究所，生物大分子国家重点实验室，北京１００１０１）蛋白质二硫键异构酶（ｐｒｏｔｅｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＰＤＩ）催化蛋白质分子内天然二硫键的形成，...

人谷胱甘肽硫转化酶基因在链霉菌的高效表达

谷胱甘肽硫转化酶(GST)是一个具有广泛底物专一性,与一些化学致癌物代谢有关的酶的一个家族.它既有谷胱甘肽硫转化酶的活性,也有过氧化物酶的活性,能使谷胱甘肽分子上的巯基(SH)与广泛的亚硝基本类化合物结合,使这类致癌物转化成无毒的化合物.它亦能与细胞内源的一些阴离子化合物(如胆红素和亚铁血红素)结合并参与运输.在人体中,GST的缺乏常与新生儿非溶血性的胆红素积累而导致的病因有关,同时GST在保护生物体过氧化反应的损伤中也起着重要的作用.

用线性动力学方法表征L-苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶的抑制作用

目的:考察用线性动力学方法表征L-苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶抑制作用的可靠性.方法:测定碱性磷酸酶水解对硝基苯酚磷酸酯(PNPP)的产物生成初速度.用两个底物浓度下标定比活性计算米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm),再据二者对抑制剂浓度的响应确定抑制剂类型和抑制常数.结果:双倒数分析法重复测定发现70%的Km和Vm随抑制剂浓度升高而同步下降,两动力学参数变化对应抑制常数的比值为(2.4±0.6,n=9).线性动力学方法所得参数精度稍高,Km和Vm随抑制剂浓度升高同时下降的出现率约80%,两抑制常数之比为(2.0±0.8,n=10),两参数变化对应的抑制常数及两抑制常数之比都与双倒数分析法一致.如允许两抑制常数之比在2.5倍内波动,则两种方法都表明L-苯丙氨酸为此碱性磷酸酶的反竞争性抑制剂.结论:此线性动力学方法可用于表征反竞争性抑制剂.

大鼠肾硫酸基转移酶基因的cDNA克隆及序列分析

在许多激素、神经递质、药物和异生化合物的生物转化中，硫酸酯化反应是一重要的代谢途径［１，２］．这些化合物的硫酸酯化通常导致其生物活性的降低及尿排泄量的增加．硫酸酯化是把３′－磷酸腺苷－５′磷酸硫酸（ＰＡＰＳ）的活性硫酸根转移到某一底物（如Ｒ－ＯＨ）．...