沙蚕蛋白酶高效降解变异新冠病毒S蛋白作用与S蛋白的生化特性分析

从今年3月起,WHO不再将新冠病毒感染,列为全球关注的灾害性卫生事件,但是新感染病例依然存在,其原因与病毒基因组经常突变,引起特异抗体失效和免疫逃逸有关,同时特异性治疗药物依然有限。病毒S蛋白是病毒感染宿主细胞的关键结构,S蛋白质突变,导致其结构生化特征和功能等随之变化。我们曾分析了世卫组织(WHO)认定的野生型和5种关切变异毒株的生化特征,并研究证实了日本刺沙蚕碱性丝氨酸蛋白酶(ASP_(NJ))可以高效与相对特异地降解野生型病毒S蛋白。本文分析了Omicron变异毒株(BA.2、BF.7、XBB.1)S蛋白质与ASP_(NJ)相关的生物化学特征,并经SDS-PAGE分析,直观证实了ASP_(NJ)可以高效降解这些S蛋白质,但变异株S蛋白抵抗ASP_(NJ)消化能力更强一些。本文还报告了ASP_(NJ)对野生型假病毒的影响,初步结果显示,ASP_(NJ)可能具有减少野生型假病毒感染293T-CAE2受体细胞的作用。这些结果表明,ASP_(NJ)有可能成为一种新工具酶,用于研究新冠病毒的结构与功能。

枯草芽孢杆菌表面展示氨肽酶的构建及协同水解大豆蛋白

氨肽酶是蛋白质深度水解的重要协同酶,但游离酶使用成本高且稳定性差,限制了其工业化应用。本研究利用表面展示技术将来源于铜绿假单胞菌GF31的氨肽酶基因Aps展示到Bacillus subtilis WB800N芽孢的表面,构建了一种易分离且稳定性好的新型全细胞生物催化剂。通过免疫荧光分析,证明氨肽酶在芽孢表面正确表达。在最适反应温度60℃、pH=9.0的条件下,氨肽酶活力最高可达75.61U/g芽孢。将表面展示氨肽酶协同碱性蛋白酶水解大豆蛋白,在60℃、碱性蛋白酶与表面展示氨肽酶加入比例为2∶1、水解pH先为10.0后为9.0的条件下,水解5.0%的大豆蛋白8h,水解度最高可达55.50%,分别是表面展示氨肽酶与碱性蛋白酶单独水解时的3.3倍、1.5倍。同时16种游离氨基酸含量大幅度提升,其中疏水性氨基酸亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量分别增加19.21mg/L、8.59mg/L和16.77mg/L,鲜味氨基酸谷氨酸、天冬氨酸含量增加13.98mg/L和4.11mg/L,说明表面展示氨肽酶在蛋白质的深度水解及对蛋白水解液脱苦、增鲜方面具有显著的作用,具有良好的工业应用前景。

麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶D246A异源表达及性质表征

以大型真菌灵芝中的麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶(MGAM)为研究对象,采用同源序列比对、同源模建、底物对接和定点突变等方法成功构建酶活力显著降低的突变体D246A.酶学性质表征结果表明:最适反应温度由野生型(wild type,WT)的65℃减少至60℃,突变体耐热能力下降;最适pH值由WT的6.0升高至7.0,有利于工程菌生长;半衰期由WT的2.0 h下降至1.5 h,酶稳定性降低.酶动力学结果表明:突变体D246A酶动力学曲线符合Michaelis方程,与WT相比,K_(m)值变大,表明酶与底物亲和力下降;V_(max)约降低至原来的1/4.

纳米花固定化蔗糖酶的研究

蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)在工业上具有较高的经济价值,可用于分解蔗糖生成果糖和葡萄糖,现今在工业化技术上存在着蔗糖酶生产果糖方法单一、活力不易保持且难以重复利用等问题。采用共沉淀法制备Mn_(3)(PO_(4))_(2)-蔗糖酶的纳米花固定化酶[以下简称Sucrase@Mn_(3)(PO_(4))_(2)],并对制备条件进行优化;同时对固定化酶的形态、结构进行表征,对固定化酶的动力学特性进行分析。结果表明:制得的Sucrase@Mn_(3)(PO_(4))_(2)纳米花颗粒分散,大小均匀,呈雏菊形、盛开状,且内部晶体结构完整;固定化酶有明显的Mn^(2+)、PO^(3-)_(4)、酶蛋白质的EDS特征峰及明显的酶蛋白质和磷酸根的FT-IR吸收特征;固定化酶表现出良好的温度稳定性和酸碱稳定性;Sucrase@Mn_(3)(PO_(4))_(2)被重复使用7次后其活性仍能保持其最初活力的40.38%;固定化酶在4℃保存28 d时仍保持40%的活性。

酱油中米曲霉酶系组成及其应用的研究进展

酱油是我国日常饮食的重要调味品,它由微生物发挥作用而形成。其中米曲霉在酱油酿造过程中拥有巨大的应用价值和潜力,它不仅赋予酱油特殊的风味,而且产生一系列有利于其他微生物生长繁殖的化合物。随着酱油发酵生产技术的不断改进与完善,对米曲霉酶学特征的研究更为迫切。本文综述了近年来国内外关于酱油酿造中米曲霉的酶系组成研究及其应用进展,包括米曲霉的蛋白质降解酶、碳水化合物降解酶、细胞壁降解酶及膜降解酶等研究内容,为改善酱油酿造过程的原料利用率及酱油生产率提供了思路,也有利于酱油发酵工业的发展,提高经济收益。

生淀粉水解α-淀粉酶Amy486的重组表达和性质分析

为明晰生淀粉水解α-淀粉酶Amy486独特的催化特征,将克隆自Exiguobacterium sp.J84菌株的amy486进行重组表达,并研究重组酶的酶学性质、嗜盐特性和钙离子依赖性。Amy486最适催化pH为7.5,在pH 6.5~8.5范围内酶活力保持40%以上,最适温度为35℃,30℃半衰期为100 h。1.5 mol/L Na_(2)SO_(4)处理可将Amy486的比酶活由1.53 U/mg提升至2209 U/mg。添加1.0 mol/L Na_(2)SO_(4),Amy486在35℃放置500 h,酶活力可保持60%以上。2.5 mmol/L CaCl_(2)可提升酶活力至110%,添加超过5 mmol/L CaCl_(2),Amy486的相对酶活力降至100%以下,EDTA孵育对Amy486蛋白的酶活力和稳定性影响较小。Amy486与钙离子结合的关键位点为K_(3)0_(2),K_(3)0_(2)E与钙离子的结合能力增强,从而降低该酶对外源钙离子的依赖性。α-淀粉酶Amy486及其突变体酶K_(3)0_(2)E是具有较高比酶活的生淀粉水解酶,对外源钙离子的依赖性较低,其活力的发挥依赖于适合的盐浓度,可应用于某些高盐环境下的淀粉水解。

鸭蛋清溶菌酶的分离纯化及致敏性评估

鸭蛋中含有丰富的蛋白质和营养成分,但鸭蛋清中含有溶菌酶,溶菌酶具有致敏性,食用鸭蛋后有可能产生过敏的风险。采用超滤法与离子交换层析法结合的方法分离纯化鸭蛋清溶菌酶,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法比对,能得到纯度较高的溶菌酶。采用免疫印迹的方法,分析抗溶菌酶的兔多抗血清和禽蛋过敏患者混合血清池分别与鸭蛋清溶菌酶的IgE结合能力,进行鸭蛋清溶菌酶的致敏性评估,实验证明IgE结合能力非常显著,溶菌酶存在交叉反应。同时证实了食用鸭蛋会引起过敏反应,也为过敏患者能否食用鸭蛋提供了依据。

南方丘陵区施肥量与2种决明生长性能关系分析

为了探讨氮、磷和钾对决明(Chamaecrista)生长的影响,本研究分别设置氮、磷和钾肥的5个施肥水平,研究不同施肥量下2种决明生物量、农艺性状的变化,以及生物量、结荚数和结瘤数与施肥量的关系。结果表明,施肥量与2种决明生物量、结荚数和结瘤数可用不同的回归模型拟合,低量N,P,K处理2种决明的综合性状表现佳,随着施肥量增加,生物量和农艺性状指标降低,羽叶决明(Chamaecrasta nictitans)综合性状优于圆叶决明(Chamaecrista rotundifolia)。生物量与圆叶决明、羽叶决明农艺性状的回归方程分别为Y=61.16+0.121X1+0.209X2-1.669X4+6.351X5和Y=110.38+0.151X1-2.02X4,决策系数从大到小的顺序分别为“结瘤数>根干重>结荚数>根长”和“结荚数>根长”。圆叶决明施肥以N1(36 kg·hm^(-2)),P1(96 kg·hm^(-2))和K1(60 kg·hm^(-2))较为理想;羽叶决明施肥以N0(0 kg·hm^(-2)),P1(96 kg·hm^(-2))和K1(60 kg·hm^(-2))较为理想。

阴离子交换树脂固定化核酸酶P1的研究

5′-核苷酸及其衍生物因具有较高的营养保健价值和药用价值,市场需求不断增大。核酸酶P1是目前5′-核苷酸工业生产的关键酶,但游离酶存在难以重复利用、消耗量过大等缺点。为了解决上述问题,提高核酸酶的利用效率,笔者利用不同类型树脂对核酸酶P1进行固定化。以核酸酶P1的吸附量和固定化酶的酶活为评价标准,研究发现阴离子交换树脂1(AER1)固定化时效果最佳,优化后的最佳固定化条件为酶量3 644.7 U/mL(2.2 mL)、戊二醛质量分数0.25%、交联时间1.5 h、固定化时间10.0 h、pH 5.1。该条件下制备的核酸酶P1的比酶活为47 980.95 U/g。在此最佳条件下,固定化酶的热稳定性有一定程度的提高;固定化酶的酸碱稳定性大幅度提高;固定化酶在4℃下保存6周后,酶活保留51.8%,是游离酶的1.6倍。

用壳寡糖修饰的方法提高酵母转化酶的催化活性

为了对来自酵母细胞的天然转化酶分子进行改造,以使其适用于工业和医药领域,利用壳寡糖(COS)对酵母转化酶(YInv)的氨基进行修饰。结果发现:COS修饰后的糖链成功连接到转化酶肽链的氨基上,修饰酶(COS-Inv)的分子量比天然酶(YInv)的明显增大;COS-Inv的催化活性比YInv的提高200.3%。YInv和COS-Inv分子中的多糖含量分别为2.75和6.34 mg/mg。COS-Inv的Km值(58.92 mmol/L)比YInv的Km值(125.45 mmol/L)低得多。YInv和COS-Inv的三维荧光光谱测定结果表明,COS-Inv的荧光强度比YInv的荧光强度低得多,说明COS-Inv与YInv两者的三维分子结构有非常大的差别。由此可见,利用壳寡糖修饰酵母转化酶以改造其分子结构是提高其催化活性的有效办法。

胆盐水解酶酶学性质与基因结构研究进展

胆盐水解酶(Bile salt hydrolase,BSH)广泛存在于哺乳动物胃肠道中,是肠道菌群在生长、繁殖过程中产生的一种胞内酶,可以调节宿主的胆汁酸平衡,影响脂质代谢,有控制胆固醇、调节肠道疾病的作用,并且BSH这种调控作用可以实现益生菌部分益生功能,因此BSH一直是研究热点。BSH结构和底物特异性的详细知识是开发BSH相关产品的坚实基础。本文介绍了BSH的来源及活性检测方法,BSH基因结构、酶学性质及底物识别机制,最后讨论了BSH在畜禽业食品工业及医药等方面的应用,期望为胆盐水解酶的深入研究及其在食品、保健品及医药方面的开发利用提供参考。

贝莱斯芽孢杆菌角蛋白酶的克隆表达、纯化及酶学性质

为了获得更好的羽毛粉降解酶,作者从贝莱斯芽孢杆菌基因组中筛选到一个角蛋白酶基因(baker1),对其克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,最后对重组角蛋白酶(BaKer1)进行分离纯化、表征及应用研究。结果表明,BaKer1的最适反应pH为9.5,最适反应温度为55℃,在中温和碱性条件下具有较好的稳定性。1 mmol/L Ca^(2+)对BaKer1有显著促进作用,5 mmol/L Mn^(2+)对BaKer1有轻微抑制作用,其他金属离子对BaKer1影响不大。PMSF对BaKer1的活性具有显著抑制作用,表明BaKer1是典型的丝氨酸蛋白酶。分别以羽毛粉、偶氮酪蛋白、酪蛋白为底物测定了BaKer1的动力学参数,Km值分别为5.06、1.09、1.39 mmol/L,k_(cat)/K_(m)值分别为1058.24、2536.54、3733.79 s·mmol/L。BaKer1处理羽毛粉,能达到酸水解效果的33.51%,说明它在羽毛粉降解过程中具有潜在的应用价值。

载脂蛋白A-I对基质金属蛋白酶-2的抑制作用机理

为了分离纯化鲢鱼基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)的内源性抑制剂,克隆并表达了鲢鱼MMP-2的催化结构域(rHm-MMP-2c),并将其作为筛选内源性抑制剂的靶标酶。通过60℃加热、50%~90%的硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose和Phenyl-Sepharose柱层析等手段,从鲢鱼肌肉中纯化了一种MMP-2内源性抑制剂,该抑制剂相对分子质量为28 ku,能有效抑制rHm-MMP-2c在4℃冷藏过程中对I型胶原的降解。质谱鉴定结果表明,纯化的抑制剂为载脂蛋白A-I(Apo A-I)。抑制动力学显示,Apo A-I对rHm-MMP-2c呈现竞争性抑制,抑制常数K_(i)为1.31μmol/L,半抑制浓度(IC_(50))为3.33μmol/L。分子对接结果显示,酶和抑制剂结合的主要作用力为氢键相互作用,抑制原因可能是Apo A-I与MMP-2纤连蛋白结合区结合形成了空间位阻,阻碍了底物与酶的结合。

纤维素酶的研究与应用进展

纤维素主要通过不同功能的纤维素酶进行降解而形成寡糖或单糖,从而为植食性动物及部分微生物提供碳源及能量,在自然界碳循环中发挥重要作用。作者在介绍纤维素及纤维素酶的基础上,综述了纤维素酶的研究进展及其在纺织、造纸、饲料、食品及能源等行业的应用。

基于酸性磷酸酯酶的生物化学综合性实验设计

本实验以酸性磷酸酯酶为研究对象,分为酶的提取、酶活检测、酶促动力学曲线测定、双倒数作图法测定Vmax和Km值和SDS-PAGE测定蛋白分子量五个部分。学生通过准备实验材料、使用仪器设备和处理化学污染物等过程,培养了职业规范、工程意识和环保意识;通过分析实验数据和优化实验过程,培养了发现和分析问题的能力;通过课堂教师思政引领、案例分析和改进实验方案,加深了对酶化学知识的理解,提高了运用科学思维和生化知识解决问题的能力。

蛋白质分析方法在生物化学实验教学中的应用

蛋白质定量定性分析是生物化学实验教学中常用的方法,在实验教学中具有非常重要的地位,也是相关专业学生在生物化学课程中深入理解和研究蛋白质的重要基础。目前蛋白质的定量分析检测方法很多,本文对比分析了生物化学实验教学中常用的多种蛋白质分析鉴定的方法,对比了不同方法的原理、仪器、药品等方面的差异与教学点的不同,适用专业类型、对实践能力培养的支撑等。

赖氨酰内切酶在大肠杆菌中的重组表达、复性及纯化

首先在产酶溶杆菌来源的赖氨酰内切酶(Lys-C)成熟肽序列的N端和C端分别融合人工前肽(MGSK)和6×His标签,将密码子优化后的序列插入表达载体pET-28a;其次以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导型启动子PT7控制Lys-C的高效表达,并针对重组菌株JM109DE3_PT7-LysC开展生物反应器高密度发酵生产Lys-C;再次收集和溶解包涵体得到Lys-C变性液,通过Sephadex G25层析脱除DTT(二硫苏糖醇),并在Lys-C复性液中添加前导肽(pre-N-pro)辅助成熟肽蛋白折叠;进一步通过切向流过滤、Ni NTA-Sepharose亲和层析和Sephacryl S-100层析等一系列纯化步骤,获得高纯度的重组Lys-C;最后进行酶切三肽底物和门冬胰岛素前体检测,分析重组Lys-C的活性水平。结果表明:重组Lys-C的发酵产量为2.4 g/L,经复性和纯化后的终产量可达48 mg/L;添加80 mg/L pre-N-pro促进了重组Lys-C的复性,复性后酶活相比于未添加pre-N-pro时提升了4.8倍,最高可达到13.8 U/L;经过多步纯化后,重组Lys-C的比酶活为10.2 U/mg,且对于门冬胰岛素前体的酶切转化率可达93.5%。

重组果聚糖蔗糖酶的克隆表达、酶学性质及产物表征

果聚糖通常以蔗糖为底物酶法催化合成,具有促进肠道益生菌增殖、抗病毒等生理功能,又可作为增甜剂和稳定剂被添加到食品中,制备意义重大。本研究将Bacillus subtilis来源的果聚糖蔗糖酶基因(LRS)克隆到pET-28a(+)上,在E.coli BL21(DE3)中表达,得到基因工程菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-LRS,后对纯化酶进行酶学性质探究及催化产物表征。结果表明,果聚糖蔗糖酶的最适温度为50℃,该温度下保温90min,剩余酶活仍为初始酶活的88%。最适pH为5.5。此外,Mn^(2+)和Ca^(2+)对酶活力有明显促进作用。在以蔗糖为底物时,Km和Vmax分别为22.06mmol/L和6.4μmol/(L·s)。对催化产物通过HPLC、核磁、红外光谱表征确定其为β-(2,6)糖苷键连接的果聚糖。本研究构建的重组果聚糖蔗糖酶具有热稳定性好,催化效率高等特点,对工业化应用有一定的指导意义。

pH渐变条件下多酶分步连续酶解工艺制备鲟鱼硫酸软骨素与胶原蛋白肽

pH渐变条件下采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶分步连续酶解鲟鱼软骨,同时制备鲟鱼硫酸软骨素和胶原蛋白肽。分别通过温度、酶解时间、酶用量3个单因素实验,研究其对连续酶解效果的影响。综合分析得出最佳条件:碱性蛋白酶酶解温度为45℃,酶解时间为2 h,酶用量为100 U·g^(-1)底物;木瓜蛋白酶的酶解温度为50℃,酶解时间为2 h,酶用量为50 U·g^(-1)底物;菠萝蛋白酶的酶解温度为50℃,酶解时间为2 h,酶用量为30 U·g^(-1)底物。该工艺条件下制备的鲟鱼硫酸软骨素提取率为85%,纯度93%,胶原蛋白肽的提取率为82%,纯度为90%。研究建立的pH渐变条件下多酶分步连续酶解工艺,产率与纯度较国内现有生产方法均有提高,且碱液使用量减少,避免了有机溶剂的引入,从而可以降低生产成本,减轻环境污染负担。

融合荧光蛋白的纤维素酶表达与性质分析

纤维素酶是能特异性分解纤维素的一系列酶,被广泛应用于食品加工处理、衣物洗涤、农业及造纸等行业。纤维素酶通过不同的水解方式协同作用将纤维素水解为寡糖或可发酵糖。在将纤维素分解成寡糖的过程中,外切葡聚糖酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)发挥了重要作用。目前关于两种酶协同作用机制和顺序尚未有明确的解释。本研究将嗜热毛壳菌来源的cbh和葡萄穗霉来源的eg分别与绿色荧光蛋白基因gfp和红色荧光蛋白基因mcherry进行融合,并电转入毕赤酵母X33进行异源表达,随后对这两种融合纤维素酶CBH-GFP和EG-MCHERRY进行了性质分析。结果表明:两种融合荧光蛋白的纤维素酶基因在毕赤酵母X33中实现了分泌表达。纯化的CBH-GFP和EG-MCHERRY的蛋白浓度与荧光强度呈正相关关系。对羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、磷酸膨胀纤维素(PASC)、滤纸(FP)、微晶纤维素(Avicel)的活性测试结果显示,CBH-GFP对CMC-Na、PASC、Avicel均有催化活性,而EG-MCHERRY对CMC-Na、PASC具有催化活性,CBH-GFP对PASC有最高比酶活(1.1 U/mg);EG-MCHERRY对CMC-Na有最高比酶活(1.9 U/mg),对比原始纤维素酶CBH和EG对不同底物的活性,融合荧光蛋白的纤维素酶能保持85%以上的酶活。CBH-GFP和EG-MCHERRY最适反应温度分别为55和50℃,最适反应pH分别为6和5,与原始纤维素酶的相应性质一致。EG-MCHERRY和CBH-GFP蛋白浓度与其荧光强度呈线性正相关且性质相近,同时在pH为6、温度为50℃的情况下均能保持80%以上的酶活,因此可用于后续的纤维素酶协同反应机制的研究。