蚯蚓纤溶酶的分离纯化研究

目的从赤子爱胜蚓(Eisenia Foelide)中分离纯化出一种相对分子质量(Mr)较小的纤维蛋白溶解组分--蚯蚓纤溶酶(EFE),为其注射剂的研制开发打下基础.方法采用盐析、透析、凝胶过滤色谱、离子交换色谱等方法分离纯化EFE,用SDS-PAGE对纯化的活性组分进行Mr测定,用酶谱分析方法初步探讨蚯蚓中存在的其它纤溶酶活性组分.结果分离纯化得到了EFE单一组分,经SDS-PAGE EFE呈单一条带,Mr约为25 000.经酶谱分析发现纤溶酶活性组分Mr分布在25000～50 000之间.结论反复使用色谱技术可分离纯化EFE,并得到单一组分.

Kex2蛋白酶在毕赤酵母中的表达、纯化和性质研究

目的研究Kex2（EC.3.4.21.61）蛋白酶在毕赤酵母中的重组表达、纯化和部分性质。方法 Kex2基因整合进p PIC9K质粒中,通过电转构建重组毕赤酵母GS115-Kex2,G418筛选多拷贝子,甲醇诱导得到目的蛋白。通过强阴离子交换层析Q-FF对重组蛋白进行纯化,对纯化后的蛋白进行酶学性质研究。结果通过毕赤酵母表达可以得到具有活性的重组Kex2蛋白酶,以Boc-Gln-Arg-Arg-p NA（叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-对硝基苯胺,Boc-QRR-p NA）为底物检测酶的活性,发酵外液活性达270U/L,SDS-PAGE检测目的蛋白的分子量为67k Da,经Q-FF纯化后,目的蛋白的活性回收率为84%。重组Kex2蛋白酶在p H 5.0~6.0之间稳定,p H 9.0时活性最高。在25℃,p H 5.0条件下放置12 h活力可保持88.2%。以Boc-QRR-p NA为底物,测得重组Kex2蛋白酶的Km值为0.0167 mmol/L,Vmax值为333.3μmol/min。结论利用毕赤酵母可成功表达分泌Kex2蛋白,经Q-FF纯化后可得到较纯的Kex2蛋白酶。

LSM蛋白增强木糖发酵重组酵母抗逆性能的研究

木质纤维素原料预处理过程中产生的弱酸、呋喃醛类和酚类化合物等对酿酒酵母的乙醇发酵有抑制作用,提高基因重组酵母对抑制物的耐受性,是利用植物秸秆水解液生产燃料乙醇的关键技术之一。研究从前期构建的戊糖、己糖共发酵重组酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae ZU-E8基因组DNA中克隆出RNA结合蛋白LSM6,将其连入含有PADH启动子的质粒构成表达载体pR-LSM,进而转入ZU-E8宿主细胞中。通过高浓度醋酸根平板筛选,得到高抗逆性木糖发酵重组酵母ZU-910。在醋酸浓度为2 g·L-1的木糖培养基中发酵96 h后,ZU-910的木糖利用率和乙醇浓度为90.2%和26.9 g·L-1,分别是出发菌株ZU-E8的8.5和10倍,并且ZU-910对糠醛和硫酸根的耐受能力也较ZU-E8大大增强。在玉米秸秆酶解液发酵中,ZU-910的木糖利用率和乙醇产量在ZU-E8基础上增加了10.5%和7.7%.证明LSM6蛋白确实能够增强木糖发酵重组酵母的抗逆能力,提高其发酵性能。该研究成果在木质纤维素替代粮食生产乙醇的产业化进程中具有良好的应用前景。