枸杞SWEET基因家族鉴定及其与可溶性糖含量关系

【目的】糖外排转运蛋白(sugars will eventually be exported transporters,SWEETs)在植物生长发育过程中发挥重要作用,解析SWEETs基因在枸杞果实发育过程中对糖积累作用,为进一步揭示SWEETs基因在枸杞果实发育过程中的作用提供参考。【方法】用生物信息学方法对枸杞SWEET基因(LbaSWEETs)进行全基因组鉴定,并用已发表的转录数据分析LbaSWEETs在果实发育时期的基因表达情况。【结果】枸杞SWEET基因家族共有37个成员,随机分布于10条染色体上,分别编码152~621个氨基酸,蛋白质分子质量为16.87~69.97 kD,等电点为4.96~9.86。亚细胞定位预测位于叶绿体或质膜,大多数含有7个跨膜螺旋。系统进化分析发现,37个LbaSWEETs蛋白可分为4个亚群,每个亚群的基因结构和保守基序组成相似。启动子元件分析表明:Lba-SWEETs基因启动子富含大量激素响应、逆境胁迫和生长发育响应元件。转录组数据和qRT-PCR分析表明:LbaSWEET9和LbaSWEET29基因表达量随果实成熟呈现显著增加。相关性分析结果表明,LbaSWEET9和LbaSWEET29基因表达量与果糖含量呈显著正相关。【结论】LbaSWEET9和LbaSWEET29基因是果糖积累的关键基因。

芝麻热胁迫响应基因SiHsfB-2b的克隆及表达特性分析

为探究B类热激转录因子(HSFs)在芝麻耐热性中的分子功能,基于前期转录组分析鉴定到的编码B类HSF家族蛋白HsfB2b的基因序列,以郑太芝3号耐热白芝麻品种为材料,采用同源克隆方法克隆了芝麻SiHsfB-2b基因,对其进行生物信息学分析,同时分析其在芝麻不同器官和热胁迫下的表达特性,并对其进行亚细胞定位。结果表明:SiHsfB-2b基因CDS序列全长为936 bp,编码311个氨基酸;系统进化树分析表明SiHsfB-2b与松蒿、独脚金和锈鳞木樨榄的同源蛋白关系较近,含保守DNA结合结构域;亚细胞定位于细胞核内;SiHsfB-2b基因启动子区域含有13类顺式作用元件,其中与胁迫响应和激素响应相关的各有3类。RT-qPCR分析结果显示,热胁迫可诱导SiHsfB-2b在芝麻根、茎和叶中上调表达,叶中相对表达量最高;在持续高温胁迫下,SiHsfB-2b在芝麻茎和叶中的表达量呈上升趋势,且在胁迫后期的叶中表现出显著上调,而根中的表达量呈现出先上升后下降趋势。综上推测,SiHsfB-2b基因可能通过介导胁迫和激素信号等通路积极响应热胁迫,这可为后期深入研究芝麻耐热性的分子机制奠定理论基础。

两个家蚕CPFL表皮蛋白基因的鉴定与表达分析

昆虫CPFL表皮蛋白是一类重要的结构蛋白。本研究通过生物信息学分析从家蚕基因组中鉴定出2个CPFL基因,命名为BmHCP1和BmHCP2。氨基酸序列分析发现,2个蛋白在羧基末端均具有CPFL表皮蛋白典型的保守结构序列YGW以及重复序列AAH、AAPA、AAPV。进化树分析显示,2个蛋白与鳞翅目昆虫艺神袖蝶(Heliconius erato)和柑橘凤蝶(Papilio xuthus)具有较高同源性。荧光定量PCR分析显示,BmHCP1和BmHCP2存在组织、时相特异性表达,幼虫期在头部、中肠、表皮等组织中表达量较高;蛹期除翅原基、血淋巴、触角和足等组织外均有较高表达量;成虫期在足、触角、翅原基、表皮等组织中表达量较高;蛹期在大多数组织的表达量明显高于幼虫期和成虫期。研究结果为进一步探明家蚕表皮蛋白基因的功能奠定了基础。

玉米籽粒皱缩突变体sh2019的分子标记初步定位

玉米籽粒作为光合产物的重要贮藏器官,其发育直接影响百粒重和产量。本研究以玉米籽粒皱缩突变体sh2019、野生型玉米自交系Mo17及两者的杂交F_(2)代为材料,进行表型分析、遗传分析和分子标记初步定位。结果表明,突变体sh2019籽粒干瘪,种皮皱缩,百粒重和出苗率均比野生型显著下降,分别下降43.55%和69.56%。遗传分析发现突变体sh2019的籽粒皱缩表型受1对隐性核基因控制。利用F_(2)分离群体借助集团分离分析法进行的分子标记定位结果表明,sh2019基因被定位于玉米3号染色体上约30.18 Mb的物理距离内。本研究结果可为开展sh2019基因的精细定位及分子标记辅助育种奠定基础。

粗穗披碱草1H^(t)S染色体特异荧光原位杂交标记开发

小麦-粗穗披碱草1H^(t)S.1BL罗伯逊易位系高抗小麦条锈病和叶锈病,是小麦遗传改良的优异基因源。我们前期利用中国春ph1b基因突变体对该易位系进行诱导,获得了一批诱导后代材料,为了从中准确鉴定小麦-粗穗披碱草1H^(t)S小片段易位系,需要建立能够覆盖粗穗披碱草1H^(t)S染色体的荧光原位杂交(FISH)标记。本研究利用21个小麦及其近缘种探针、61个基于中国春基因组序列新开发的小麦1BS染色体探针以及40个根据简单三碱基重复序列新开发的探针对小麦-粗穗披碱草1H^(t)S.1BL易位系进行非变性FISH分析。结果显示,B74、B76和B77等36个探针(33个为新开发的)在1H^(t)S染色体上具有杂交信号,并且杂交信号可分为仅在染色体末端、仅在着丝粒处、同时在着丝粒处和近着丝粒处、覆盖1H^(t)S约3/4染色体臂、覆盖绝大部分1H^(t)S共五种类型。因此,部分探针单独使用或多个探针联合使用,其信号能覆盖1H^(t)S染色体,能够满足小麦-粗穗披碱草1H^(t)S小片段易位系鉴定,这可为小麦背景中粗穗披碱草染色质追踪提供新的检测手段。

王族海棠Alfin-like家族基因的鉴定及盐胁迫下的表达分析

Alfin-like(AL)转录因子家族对非生物胁迫反应具有重要的调控作用。本研究采用同源比对的方法检索鉴定王族海棠AL转录因子家族基因,系统分析其生物信息学特性,并采用qRT-PCR方法分析其在盐胁迫下的表达模式,以期为揭示AL家族在王族海棠响应盐胁迫中的生理功能提供理论依据。结果表明,从王族海棠基因组中共鉴定出11个MdALs基因,分布在6条染色体上,分别命名为MdAL1—MdAL11。MdALs转录因子具有高度保守的Alfin结构域和PHD锌指结构域,含4~10个内含子;上游启动子区域有大量与植物激素和非生物胁迫响应相关的顺式作用元件,且基因片段复制事件在MdAL基因家族的扩展中起着至关重要的作用。转录组分析显示MdALs基因主要在王族海棠生育后期高表达。qRT-PCR分析进一步表明,MdALs基因在王族海棠遭受盐胁迫下的表达模式不同,盐胁迫下,MdAL3、MdAL4、MdAL6基因的表达量整体上调,尤其MdAL4基因,其表达水平随着盐胁迫处理时间的延长呈显著增加趋势。综上,王族海棠AL转录因子家族与植物响应激素变化和非生物胁迫密切相关,尤其是MdAL4基因,强烈响应盐胁迫,这可为利用基因工程技术改良王族海棠种质奠定基础。

蒺藜苜蓿MtbHLH25基因克隆、亚细胞定位及表达分析

[目的]bHLH转录因子数量众多,能够广泛参与植物的生长发育和逆境胁迫等过程。试验以蒺藜苜蓿R108为材料,克隆MtbHLH25基因并探究其功能,为研究蒺藜苜蓿bHLH转录因子的功能提供帮助。[方法]通过PCR扩增技术从蒺藜苜蓿中克隆MtbHLH25基因和启动子,构建酵母表达载体,并用LiAc转化法转移到Y2H Gold酵母菌株中进行酵母自激活检测,构建亚细胞定位载体,并通过冻融法转入农杆菌EHA105,菌液注射到烟草下表皮细胞后,用SP8激光共聚焦显微镜观察,通过实时荧光定量PCR技术研究MtbHLH25基因的时空表达水平。[结果](1)从蒺藜苜蓿中克隆出MtbHLH25基因和启动子,该基因总长882 bp,共编码293个氨基酸。启动子序列分析表明其包含ABA、MeJA、GA和SA等响应元件。(2)MtbHLH25蛋白与蚕豆和长柔毛野豌豆中bHLH蛋白高度同源。(3)MtbHLH25蛋白定位于细胞核。(4)酵母自激活检测结果显示MtbHLH25蛋白具有自激活活性。(5)MtbHLH25在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花和果实中均有表达,其中在根中表达水平最高;外源SA、MeJA、ABA、GA以及盐胁迫使MtbHLH25基因表达量都呈下降趋势,表明SA、MeJA、ABA、GA以及盐胁迫对MtbHLH25基因表达起负调控作用。干旱胁迫能够显著诱导MtbHLH25基因表达量上调,说明该转录因子在干旱胁迫中起正调控作用。[结论]MtbHLH25基因对盐胁迫敏感,在干旱胁迫中发挥正调控作用;MtbHLH25蛋白具有自激活活性,对下游启动子调控的报告基因具有激活作用。

多星韭AwCHI 1的克隆与分析及真核表达载体的构建

查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮物质合成途径中的关键酶,能催化柚皮素查尔酮生成柚皮素,进而转化生成各种类型的黄酮类化合物。根据多星韭(Allium wullichii)转录组测序结果,运用PCR技术克隆获取多星韭查尔酮异构酶的编码基因(AwCHI 1),对基因序列进行分析,同时与真核表达载体pBI121进行连接,将其转入农杆菌GV3101感受态细胞中,完成农杆菌的转化。研究结果不仅为该基因的功能解析研究奠定了基础,也为多星韭类黄酮代谢途径的研究提供了重要基因资源。

基于全基因组关联分析的水稻穗长QTL定位及其候选基因分析

分别于2021年和2022年在湖南长沙种植254份水稻3K种质资源,在成熟期测定各种质的穗长。结合种质基因型进行全基因组关联分析,共检测到3个穗长QTL,分布于水稻第1、5、6号染色体,分别命名为qPL-1、qPL-5和qPL-6,相对贡献率为9.06%~28.27%;结合QTL区间内基因功能注释和基因不同单倍型的穗长差异显著性分析结果,最终获得qPL-1、qPL-5和qPL-6的候选基因,其中qPL-6与sped1-D共定位,Os01g0715600、Os05g0132700为调控穗长的新候选基因;对Os01g0715600、Os05g0132700和Os06g0597500的单倍型进行聚合分析,发现这3个基因存在累加效应。

烟草NPR1基因家族鉴定及其在南方根结线虫胁迫下的表达分析

本研究旨在挖掘烟草抗南方根结线虫病程相关基因非表达子NPR1(non-expressor of PR genes)家族成员,并明确其功能。基于拟南芥AtNPR1家族成员蛋白序列,利用生物信息学方法鉴定分析烟草NtNPR1基因家族成员及其特征。通过qRT-PCR检测南方根结线虫侵染后抗病(NC95)、感病(长脖黄)烟草品种Nt-NPR1家族重要候选抗性基因的相对表达量,采用LC-MS/MS方法对2个品种烟草根系内源水杨酸含量进行检测。结果表明,从普通烟草基因组中共鉴定到12个NtNPR1基因,这些基因被分为3个亚组,同一亚组中NtNPR1家族成员蛋白结构、保守基序的长度和位置都极为相似。编码氨基酸长度范围为462~588,均为亲水性蛋白,均位于细胞核。南方根结线虫侵染抗、感烟草品种后,根系中水杨酸含量、NtNPR1基因家族成员表达量在抗病品种中均升高,在感病品种中则降低,其中NtNPR6的变化最为明显。综上,NPR1基因与烟草南方根结线虫抗性密切相关,NtNPR6基因可作为烟草响应南方根结线虫胁迫的重要基因。

核桃铵态氮转运蛋白基因JrAMT2的功能分析

【目的】研究高效利用氮素基因铵态氮转运蛋白基因JrAMT2,对核桃Juglansregia的品种改良、快速生长及产量形成有重要意义。【方法】以核桃JrAMT2过表达幼苗为实验材料,对JrAMT2基因进行生物信息学分析。通过基因表达量和表型测定对核桃JrAMT2过表达植株生长发育、氮素吸收、叶绿素质量分数、叶绿素荧光进行理化分析。【结果】JrAMT2基因在核桃JrAMT2过表达植株中稳定表达。与野生型相比,核桃JrAMT2过表达株系的株高、节间长、生物量等生长参数显著提高(P<0.05),核桃幼苗的株高、节间长增加,最高可增加68.2%和50.3%,植株地上部分、地下部分生物量显著增加,地上部分最高可增加56.26%(鲜质量)和56.26%(干质量),地下部分最高可增加344.38%(鲜质量)和354.33%(干质量);核桃JrAMT2过表达株系地下部分对铵态氮及硝态氮的吸收显著提高(P<0.05),最高可提高114.1%和70.3%,其中JrAMT2基因介导了铵态氮从地下部分到地上部分的运输,地上部分铵态氮质量分数显著增加(P<0.05),最高可增加59.1%;核桃JrAMT2过表达植株叶绿体表面积与单层细胞表面积比率、叶绿素质量分数显著增加(P<0.05),最高可增加22.94%和74.3%;对叶绿素荧光参数分析,核桃JrAMT2过表达植株叶片放氧复活体活性、量子产额、电子传递效率均显著提高(P<0.05)。【结论】核桃JrAMT2基因在核桃幼苗生长发育、氮素吸收和光合作用中均有积极显著调控的作用,为进一步研究核桃快速繁育提供一定的理论依据,且为筛选优良品种奠定一定基础。

蓝色七彩神仙鱼虹彩细胞呈色相关基因的发掘

为发掘蓝色体色中与虹彩细胞呈色相关的基因,实验选取全蓝、白化全蓝七彩神仙鱼分别与全白七彩神仙鱼的皮肤组织,进行比较转录组学分析。结果显示,全蓝与全白七彩神仙鱼皮肤组织转录组序列比对,共有2192个差异表达基因(DEGs),其中1270个基因上调,922个基因下调,DEGs主要富集至嘌呤核苷酸生物合成过程、肌动蛋白结构组织、嘌呤化合物生物合成过程、氧化磷酸化和柠檬酸循环等代谢通路。白化全蓝与全白七彩神仙鱼转录组序列比对结果显示,共有3168个DEGs,其中1859个基因上调,1309个基因下调,主要富集在氧化磷酸化、核糖核苷二磷酸代谢过程、ADP代谢过程、阳离子结合和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等通路。为进一步发掘与虹彩细胞呈色相关的候选基因,通过数据库比对分析,在全蓝与全白七彩神仙鱼筛选出32个DEGs,在白化全蓝与全白七彩神仙鱼筛选出38个DEGs,其中alkal2b、gpnmb、fhl2、pka与虹彩细胞发育相关,pgam、prtfdc1、pnp、slc23a1、slc2a9、rab38、rdh10、psat1、paics与虹彩细胞中鸟嘌呤合成及运输相关。本研究为深入解析鱼类蓝色结构色的形成和调控机制奠定基础。

三孢布拉霉CrgA泛素连接酶功能的初步探究

CrgA已经被证实是三孢布拉霉和一些其他丝状真菌中类胡萝卜素生物合成的一个负调控因子。环指结构域的存在表明,CrgA可能具有泛素连接酶的功能,是泛素化调节系统中的一个关键酶。为了验证这一假设,从三孢布拉霉中分离并鉴定了一种泛素激活酶(BtE1)和18种假定的泛素结合酶(UBC)。生物信息学分析表明,18种UBC蛋白质都包含一个UBC的保守结构域,表明它们都属于泛素结合酶。系统发育关系分析表明,18个UBC蛋白质属于7个蛋白质亚家族。根据系统进化分析结果筛选出6种候选UBC蛋白质,通过异源表达及亲和纯化得到BtE1、6种BtUBC蛋白质、BtCrgA和BtWC-1b,并在体外进行泛素化反应,BtCrgA能在BtE1和BtUBC D的协助下完成对自身的泛素修饰功能。

利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代

转基因技术有助于番茄基因功能研究和遗传改良,其中转基因后代的筛选是一个非常重要但工作量大的环节。本研究基于番茄油体蛋白基因家族序列分析和番茄基因表达数据库SGN-TEA搜索结果,克隆了一个种子特异且高水平表达的油体蛋白基因SlOLE1(Solyc06g034040)。利用无缝克隆的方法将红色荧光蛋白基因TagRFP的编码区序列插入到SlOLE1基因的终止密码子前,形成一个嵌合基因SlOLE1-TagRFP。将嵌合基因插入到pBI121双元载体,构建植物表达载体pSlOLE1-TagRFP,利用农杆菌介导法转化番茄品种‘Money Maker’,T_(0)代植株的自交种子在荧光显微镜下呈现出明亮红色荧光或无荧光。PCR分子标记进一步验证发现,红色荧光种子萌发的幼苗均存在TagRFP序列,表明在种子阶段检测红色荧光筛选转基因番茄后代的准确率为100%。由此,本研究建立了一种利用SlOLE1-TagRFP嵌合基因,可以通过种子红色荧光可视化分析,简单快速、低成本地鉴定转基因番茄后代的方法。

利用CRISPR/Cas9基因编辑片段敲除技术创制玉米多样化等位变异

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制等位变异已经成为众多植物中增加种质资源多样性的重要手段。提高玉米等谷物中类胡萝卜素含量是发展中国家解决维生素A缺乏症的一种经济方法。本研究以玉米中调控类胡萝卜素合成的基因crtRB1为研究对象,利用双靶标片段缺失性基因编辑技术,在原生质体中对crtRB1的启动子顺式元件进行片段敲除,获得了具有片段缺失和InDel(插入或缺失)的多样化等位变异,这为在玉米中实现稳定的crtRB1启动子元件的缺失突变奠定了基础,对启动子元件的功能研究和玉米的品质改良具有重要意义。

烟草NtPXG基因克隆、表达特征及其功能分析

【目的】克隆烟草氧脂素合成关键基因NtPXG,探究该基因对生物/非生物胁迫以及植物生长调节剂的响应,为解析NtPXG基因响应烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的作用机制提供参考。【方法】利用同源克隆法克隆NtPXG基因,采用生物信息学方法分析基因结构与蛋白质性质;通过qRT-PCR对不同发育期的组织以及机械损伤、干旱、不同植物生长调节剂处理下烟草NtPXG基因的表达模式进行分析;利用叶盘转化法获得过表达NtPXG基因烟草后,进行基因功能分析。【结果】NtPXG基因长度为744 bp,共编码247个氨基酸;NtPXG基因的表达模式分析显示,其在烟草不同时期部位的表达量具有明显的组织和发育特异性,对不同的非生物胁迫和植物生长调节剂也会产生响应;NtPXG基因过表达烟草表现出明显的TMV抗性。【结论】烟草NtPXG基因不仅参与烟草的生长发育,同时也参与烟草对生物胁迫和非生物胁迫的响应,推测NtPXG基因可能通过植物生长调节剂信号响应外界的胁迫。通过烟草中过表达NtPXG基因;证明了NtPXG基因可通过JA信号通路抑制TMV的增殖。

高粱深根基因SbDRO1的克隆及功能验证

干旱严重影响作物的生长和产量,根系的结构及分布情况是植物响应干旱胁迫的关键因素。高粱作为一种耐旱性较强的作物,挖掘其抗旱相关基因对于作物抗旱改良具有重要的作用。本研究在高粱中克隆得到深根基因SbDRO1,对其进行生物信息学分析,并在拟南芥中进行功能验证。结果表明,SbDRO1基因CDS全长759 bp,编码252个氨基酸;在拟南芥中过表达SbDRO1能够显著提高拟南芥在干旱条件下的存活率,且转基因拟南芥的根系相对野生型明显发达。进一步研究发现,涉及生长素合成、极性运输以及抗逆相关基因的表达量在转基因拟南芥中显著提高,这或许是SbDRO1基因提高转基因拟南芥抗旱性的主要分子机理。本研究结果可为农作物抗旱改良提供潜在的基因资源。

石榴蔗糖代谢相关酶SPS和INV基因家族鉴定与表达分析

蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖转化酶(INV)是蔗糖代谢的关键调控酶,在植物生长发育过程中起重要作用。本研究利用生物信息学和荧光定量PCR等分子手段,鉴定石榴SPS和INV基因家族成员,分析其理化性质、保守结构域、保守基序、二级结构、亚细胞定位、系统进化关系和表达模式。结果表明,从石榴基因组中鉴定出4个SPS基因和11个INV基因,其编码蛋白均为不稳定蛋白,具有典型的保守结构域,家族成员间特征motif数量和种类大致相同,蛋白结构高度保守;这些蛋白不均匀地分布在染色体上,均定位于叶绿体中,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。石榴SPS和INV基因家族成员间存在不同程度的亲缘关系,与巨桉同源性较高;不同SPS和INV基因在石榴果实不同发育时期的表达模式存在差异,PgINV3在9月15日(果实增大期)表达水平最高,显著高于其他时期。本研究结果对解析石榴果实中蔗糖代谢的分子机理具有重要意义。

三角梅二氢黄酮醇-4-还原酶基因的克隆及表达特异性分析

【目的】克隆分析三角梅(Bougainvillea spectabilis)二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydroflavonol-4-reductase,DFR)基因(BsDFR),探讨其在三角梅苞片呈色中的作用。【方法】基于三角梅转录组数据,利用PCR技术克隆BsDFR基因,并通过生物信息学工具分析其分子特性;通过分子对接技术预测BsDFR底物特异性;采用实时荧光定量PCR分析该基因在不同颜色三角梅中的表达量差异。【结果】三角梅BsDFR基因(GenBank ID:ON417750)编码区全长987 bp,编码328个氨基酸。BsDFR理论相对分子质量为36.48 kDa,等电点pI为6.33;具有DFR特有的NADPH及底物特异结合位点,属于Asn型DFR;不具有跨膜结构及信号肽,定位于细胞质中;二级结构中α螺旋占比最多,三级结构预测显示为二聚体蛋白。底物对接模拟预测BsDFR对二氢山柰酚(Dihydrokaempferol,DHK)、二氢槲皮素(Dihydroquercetin, DHQ)和二氢杨梅素(Dihydromyricetin, DHM)3种底物均具有催化活性,与结构分析相吻合。进化树分析其与石竹目(Centrospermae)植物聚为一类。qRT-PCR分析发现其在橙色系三角梅中含量较高,进一步推测其主要底物为DHK,催化生成橙色系花青素(天竺葵素)的前体物质——无色天竺葵素苷元。【结论】BsDFR基因是一个典型的植物二氢黄酮醇-4-还原酶基因,主要与橙色系三角梅苞片色素合成有关。

春大白菜可溶性糖代谢及转运相关基因表达模式分析

以春大白菜品种‘吉锦’和‘华耐’为材料,探索了春大白菜从幼苗期到叶球收获期的整个发育过程中可溶性糖类的积累变化规律及相关代谢酶和转运蛋白基因的表达模式。结果表明:在春大白菜发育过程中,可溶性总糖和葡萄糖在莲座期和结球初期快速积累,葡萄糖积累占优势,果糖则在结球后期结球叶的叶柄中含量快速增加。莲座叶和结球叶的柄部都是可溶性糖积累的重要部位;蔗糖合酶基因BrSUS1与两个品种叶柄中可溶性糖积累密切相关。分解蔗糖的酶基因BrSUS5、BrSUS6、BrCINV2及糖转运蛋白基因BrSUC4、BrTMT1、BrSWEET17、BrERDL6-16均在叶柄部位活跃表达,不同程度参与两个白菜品种的可溶性糖积累和分布。BrERDL6-16在两种白菜结球后期多个部位中的表达量急剧升高,可能在促进大白菜叶球发育中发挥特殊作用。本研究结果可为从分子水平调控大白菜可溶性糖积累分配及产量形成提供理论依据。