中国白梨S基因研究Ⅰ 7个品种S基因型的确定和2个新S基因的鉴定

梨S基因型的确定对授粉品种的选择具有指导作用.采用PCR-RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验,鉴定了两个新S-RN ase基因,分别为S17-RN ase和S21-RN ase,同时确定了7个白梨品种的S基因型.S17-RN ase和S21-RN ase基因的内含子大小分别为142 bp和139 bp,HV区长度分别为16个和15个氨基酸,信号肽-P2的推导氨基酸长度分别为99个和98个氨基酸,信号肽大小均为27个氨基酸,C1大小均为11个氨基酸,C2大小均为12个氨基酸.白梨品种海棠酥、六瓣、恩梨、鸭梨、大核白、香椿、青梨等品种的S基因型分别为S1S12S19、S17S19、S1S19、S1S21、S16S19、S3S19、S19S19.该研究可为梨遗传改良和丰产栽培提供重要的理论依据.

锌指核酸酶在基因组靶向修饰中的应用

同源重组和逆转录病毒介导转基因法是目前基因组修饰中常用的两种主要方法.由于这些传统方法效率低,特异性差等缺点,制约了其在研究中的应用.锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)是一种人工合成酶,含有锌指蛋白DNA结合域和非特异性核酸酶FokI结构域.ZFN在对基因组的靶向修饰时,表现出高度特异性和高效性.最新研究结果显示,锌指核酸酶在哺乳动物细胞和斑马鱼基因组靶向敲除的效率高达20%.这一技术的出现,将给基因组靶向修饰的研究和应用领域带来革命,特别是在基因治疗人类疾病方面有巨大的潜力和广阔的前景.

快速构建CRISPR/Cas9基因组靶向编辑系统

CRISPR/Cas9核酸酶作为一种新的基因组靶向编辑技术,已成功应用于多种动植物基因组修饰研究.CRISPR/Cas9作用后的阳性细胞筛选和富集是该技术的关键之一.本研究以鸡EAVHP(endogenous avian retrovirus-HP)基因和MSTN(myostatin)基因为例,从靶位点的选择、表达载体构建、双基因报告载体构建和核酸酶活性验证4个方面,系统研究了CRISPR/Cas9核酸酶技术平台.结果表明,利用寡聚核苷酸直接退火方法,构建表达载体和报告载体的阳性率分别高达100%和89.5%.报告载体的PuroR(puromycin resistant gene)和e GFP(enhanced green fluorescent protein)基因的成功表达表明,构建的CRISPR/Cas9系统能有效切割靶序列,并用于后续阳性克隆的筛选和富集.本方法摒弃了传统分子克隆的PCR扩增和酶切处理目标基因的方法,而是利用寡聚核苷酸直接退火获得含有黏性末端的目标DNA,简化了载体构建过程,低成本且快速获得CRISPR/Cas9基因组靶向编辑系统.

CdTe量子点对胰凝乳蛋白酶的荧光标记

用巯基丙酸作为表面修饰剂在水相中制备了稳定的CdTe纳米量子点。利用量子点外层包被的巯基丙酸上的羧基,实现了量子点与胰凝乳蛋白酶的直接偶联。偶联后溶液的吸光度值略有增大而吸收峰位不变,同时荧光强度明显增强,荧光发射峰位稍有蓝移。通过荧光发射光谱确定了CdTe量子点与胰凝乳蛋白酶偶联的最佳反应条件为:pH9.0,反应温度37℃,反应时间1.5 h。重点考察了NaCl浓度和胰凝乳蛋白酶浓度对量子点与胰凝乳蛋白酶偶联产物荧光强度的影响。

基于CRISPR-Cas系统的基因组定点修饰新技术

CRISPR(clustered regulatory interspersed short palindromic repeat)序列源于原核生物的一种获得性免疫系统,协同Cas(CRISPR-associated)蛋白家族参与抵抗噬菌体或其它病毒的二次感染,广泛存在于细菌(60%)和古菌(90%)中.病菌和宿主的共同进化导致了CRISPR-Cas系统具有多样性,可分为3大类(Ⅰ-Ⅲ),又分为10亚类.在Ⅱ型CRISPR-Cas系统基础上建立了RNA介导的CRISPR-Cas系统来修饰(删除、添加、激活、抑制)靶细胞中特定的基因序列,现已在人类细胞、小鼠、斑马鱼、酵母、细菌、果蝇、线虫、拟南芥中得以应用.本文主要介绍了Ⅱ型CRISPR-Cas系统的结构特点、作用机理及作为新型基因组定点修饰技术的研究进展,分析该技术优势,并展望CRISPRCas系统的应用前景.

油菜线粒体DNA提取纯化方法研究

以油菜为实验材料,探讨了植物线粒体DNA提取纯化过程中的影响因素,构建了一套快捷、经济、高效的植物线粒体DNA提取纯化方法.该方法结合差速离心和密度梯度离心分离得到线粒体,酶消化处理去除其他基因组的污染,用SDS与蛋白酶裂解线粒体,通过高盐沉淀,有机溶剂抽提,最后再用CTAB纯化得到mtDNA.用该方法提取的油菜线粒体DNA,经紫外分光光度计测定其纯度、限制性内切酶进行酶切.结果表明,此提取方法得到的mtDNA,其纯度可以满足后续遗传学分析.该法适用于不同植物材料mtDNA的提取纯化.

丙型肝炎病毒特异性核酶对HepG2.9706细胞HCV5′NCR基因表达的抑制作用

为探讨锤头型核酶抗丙型肝炎病毒的作用 ,根据HCV 5′NCR及翻译起始区的二级结构 ,设计及合成了 1个锤头型核酶RzA .将其插入pCI neo表达载体的多克隆位点 ,构建了表达RzA的质粒pHCV RzA .采用转基因细胞模型HepG2 970 6细胞 ,评价了pHCV RzA质粒对HCV 5′NCR调控荧光素酶表达的抑制活性 .结果表明 ,在HepG2 970 6细胞中 ,pHCV RzA以序列特异性、剂量依赖性方式抑制荧光素酶基因的表达 ,抑制率达 80 % ,提示核酶有可能作为HCV感染基因治疗的一种有效途径 .

TALE核酸酶介导的基因组定点修饰技术

TALE核酸酶(TALE nucleases,TALENs)是继锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)技术以来的另一种能够对基因组进行高效定点修饰的新技术.TALENs技术是基于植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的一种转录激活子样效应因子(transcription activator–like effectors,TALEs)而设计和构建的.TALEs蛋白是由N端分泌信号、中央DNA结合域、1个核定位信号和C端激活域构成;TALE核酸酶是将TALE蛋白中的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合,设计和构建的能在特定位点产生双链断裂的TALENs.研究结果显示,人工构建的TALENs能够对动植物细胞的基因组进行高度特异和高效的修饰.TALENs的活性在酵母、植物和哺乳动物包括人的细胞中已经相继得到验证.本文介绍了TALENs的结构特点、作用原理、构建方法和双链断裂的修复机制及其在动植物细胞基因组定点修饰中的应用,剖析了该技术可能存在的问题,展望了TALENs应用前景.

荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性T淋巴细胞方法的探讨

用绿色荧光前体化合物CalceinAM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应。通过对一系列标记条件的研究:不同浓度CalceinAM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定CalceinAM荧光素标记法的最佳条件。用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb/c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E/T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65%。通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性。

绿色木霉葡聚糖内切酶cDNA基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

用L-山梨糖诱导绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711纤维素酶基因的转录,提取其总RNA反转录获得cDNA。PCR扩增葡聚糖内切酶(EG)和葡聚糖内切酶(EG)的cDNA基因,将其克隆到酵母载体中,构建产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。重组菌株能够识别EG和EG自身携带的信号肽而将表达产物分泌到胞外,故可采用刚果红平板染色法筛选具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的重组转化子。重组菌株表达的EG酶活在诱导70h时达到最高(为0.08U/ml),表达的EG酶活在诱导60h时达到最高(为0.03U/ml)。

复方西红花膏对损伤组织bFGF mRNA表达的影响

目的 :研究复方西红花膏对损伤组织 b FGF m RNA基因表达的影响 ,探讨其促进损伤组织修复的作用机理。方法 :采用打击造模的方法 ,将 60只 Wistar大白鼠造成急性软组织损伤模型。随机将造模后动物分为空白对照组 ;阳性药物 (万花油 )对照组 ;复方西红花膏治疗组。观察用药 2天、4天、7天、1 0天 b FGF m R-NA水平的改变。结果 :复方西红花膏早期能提高损伤组织中 b FGF m RNA基因表达水平 ,且复方西红花膏组b FGF m RNA基因表达水平下降比其它两组缓慢。结论 :复方西红花膏通过调节 b FGF m RNA水平 ,直接刺激成纤维细胞及细胞外基质的蛋白合成 ,形成胶原纤维。并与相应的受体结合 ,诱导内皮细胞的迁移 ,促进毛细血管的增生 。

氯乙烯致染色体损伤的易感性与APE1和XRCC1基因多态关系研究

目的探讨脱嘌呤-脱嘧啶核酸内切酶（APE1）和X线交叉互补基因1（XRCC1）基因多态与氯乙烯致外周血淋巴细胞染色体损伤易感性的关系。方法采用双核淋巴细胞微核的方法评价个体染色体损伤水平，采用引入错配碱基创造酶切位点的限制性片断长度多态（CRS-RFLP）和PCR-RFLP技术对75名氯乙烯接触工人APE1Asp148Glu，XRCC1Arg194Trp、Arg280His及Arg399Gin多态位点进行检测。结果研究对象中APE1 148（Asp/Asp、Asp／Glu、Glu/Glu）三种基因型频率分别为38．7％、44．0％和17．3％；XRCC1 194（Arg／Arg、Arg／Trp、Trp／Trp）三种基因型频率分别为75．5％、21．3％和4．0％；XRCC 1280（Arg／Arg、Arg／Hi、His／His）三种基因型频率分别为69．3％、30．7％和0；XRCC 1399（Arg／Arg、Arg／Gln、Gln/Gln）三种基因型频率分别为49．3％、45．3％和5．3％。多因素poisson回归分析结果表明，女性发生染色体损伤的危险性是男性的1．6倍（95％CI 1．2284～2．0699，P=0．0004），XRCC1 194Arg／Arg基因型个体发生染色体损伤的危险性是Arg／Trp、Trp／Trp基因型个体的0．6898倍，（95％CI 0．4997～0．9333，P=0．0195）。单体型分析结果表明，TGG／CGG和TGG／CAG单体型对组微核率均低于野生纯合子单体型（CGG／CGG）（P〈0．05）。结论女性和XRCC1 194 Arg/Arg基因型个体为氯乙烯致染色体损伤的易感人群。

CRISPR/Cas9系统在疾病模型和基因治疗中的应用

基因编辑技术的出现成功地改变了实验材料的基因序列,这为研究疾病的分子机理提供了极大的便利.然而,传统的基因编辑技术由于缺乏精确定位、随机性插入引起位置效应等原因而制约了其发展.随着规律成簇间隔短回文重复CRISPR(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat)/CRISPR相关核酸酶Cas(CRISPR-associated nuclease)系统的出现,简便高效的基因编辑技术在疾病模型的构建,损伤基因的修复和功能性基因的研究中已得到广泛应用,产生了十分重要的影响.本文就CRISPR/Cas9系统的结构特点、作用机理以及近两年来在疾病模型构建和基因治疗中的应用进行综述,以便读者了解相关领域的研究进展.

绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅰ基因的克隆与表达

采用RTPCR方法克隆到绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅰ(EGⅠ)的cDNA序列,测序后构建到酿酒酵母诱导型表达载体pYES2上,转化酿酒酵母,转化子用2%的βD半乳糖进行诱导,用Northern杂交、刚果红染色法和CMC糖化力法分别对目的基因的转录和表达产物的葡聚糖内切酶活性进行检测.结果表明,EGⅠ的cDNA基因开放阅读框长度为1377bp,编码459个氨基酸,推测蛋白质分子量为48.1kD.刚果红染色显示,转化子可产生明显的水解圈;CMC酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的EGⅠ并分泌到胞外.发酵液中的酶活在培养60h达到最高0.06UmL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为5.4.

针对bcl─2RNA核酶体外切割反应的琼脂糖凝胶电泳

目的：用琼脂糖凝胶电泳检测体外ｂｃｌ┐２ｃＤＮＡ和ＲＺＤＮＡ转录物与鉴定核酸的体外切割活性．方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳．结果：琼脂糖凝胶电泳可见核酶和ｂｃｌ－２ＲＮＡ转录物及其切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ后的产物．

泽泻26S rDNA的扩增及酶切反应条件优化

采用PCR-RFLP技术对采集自福建、江西、四川3个地区5个泽泻样品的26S rDNA进行扩增和酶切分 析,并对其PCR扩增及酶切反应的条件进行一系列优化,建立了最优的PCR扩增及酶切反应体系,为泽泻栽培 种的分子鉴定奠定了技术基础。

稀土金属离子对5’-AMP和3’,5’-cAMP的水解切断作用

用 HPL C法研究了稀土金属离子 RE3+ (如 L a3+ ,Ce3+ ,Nd3+ ,Sm3+ ,Eu3+ ,Tb3+ )对 5’-腺苷 -磷酸 (5’-AMP)和 3’,5’-腺苷环磷酸 (3’,5’- c AMP)的催化水解切断作用。结果表明 :在温和条件下 ,稀土金属离子对 5’-AMP无明显的切断作用 ,而 Ce3+ 对 3’,5’- c AMP有很好的切断作用 ;另外 ,H2 O2 的加入能极大地促进稀土金属离子对 5’- AMP和 3’,5’- c AMP的水解切断作用。 p H值对稀土金属离子水解切断 5’-

PDGF受体β亚单位2个不同切割位点核酶的体外切割效率的比较

目的研究针对大鼠PDGF受体β亚单位基因2个不同切割位点核酶的体外切割活性并加以比较。方法应用计算机对大鼠PDGF受体β亚单位mRNA二级结构进行模拟,设计针对PDGF受体β亚单位mRNA 4 5位CUU和2 5 2位CUU的锤头状(Hammerhead)核酶(Ribozyme)基因RZ1和RZ2 ,定点克隆于自我切割型核酶载体P1 5的5′cis核酶和3′- cis核酶之间;将大鼠PDGF受体β亚单位cDNA6 0 8bp的PCR片段克隆于pGEM T载体T7启动子下游,在T7启动子作用下分别体外转录成RZ1、RZ2和70 6nt的PDGF受体β亚单位mRNA ,比较RZ1和RZ2对70 6nt的PDGF受体β亚单位mRNA的切割活性的差异。结果RZ1在体外有较高的切割活性,而RZ2在体外无切割活性。结论提示在应用核酶技术进行基因治疗时,应选择有效的核酶切割位点,以达到有效的治疗目的。

AFLP分子标记技术的改进——内切酶EcoRⅠ/TruⅠ组合与EcoRⅠ/MseⅠ组合的比较

通过对EcoRⅠ/TruⅠ与EcoRⅠ/MseⅠ两个双酶切组合的比较,证明在AFLP标记体系中,完全可以用内切酶TruⅠ替代昂贵的内切酶MseⅠ。EcoRⅠ与TruⅠ可同时加入,在不同温度下分段进行酶切:37℃酶切4 h,然后65℃酶切2 h,可达到分步酶切的效果。