四季秋海棠BsMYB62的抗旱性功能研究

【目的】以前期从四季秋海棠叶片中克隆得到的R2R3型MYB转录因子BsMYB62为研究对象,分析其在干旱胁迫下的功能。【方法】对四季秋海棠MYB62蛋白进行亚细胞定位,并通过实时荧光定量PCR方法明确BsMYB62基因在四季秋海棠根、茎、叶、雄花和雌花5个组织部位中的表达情况;构建BsMYB62基因的过表达载体转化到拟南芥,观察过表达转基因株系与野生型植株在萌发期和幼苗期遭受干旱胁迫时的生长表型、种子萌发和根长情况,测定各株系在幼苗期干旱胁迫处理时的叶绿素荧光参数PSⅡ最大光化学效率(F_(v)/F_(m)),叶绿素、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)含量,抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性以及转基因株系中BsMYB62基因的相对表达量变化。【结果】BsMYB62定位于四季秋海棠的细胞核,其在根、茎、叶和雌雄花中均有表达,其中以根和茎中的表达水平较高。在MS培养基中,野生型拟南芥和3个BsMYB62过表达转基因株系(OE1、OE2和OE3)的发芽率和长势均无显著差异,而在200 mmol/L甘露醇(模拟干旱胁迫)培养基中,OE1、OE2和OE3在胁迫处理后前2 d的发芽率及主根长均显著高于野生型拟南芥,幼苗长势也明显优于野生型。置于培养土中干旱胁迫1 d时,OE1、OE2和OE3的BsMYB62即被显著诱导;干旱胁迫13 d时,OE1、OE2和OE3的F_(v)/F_(m)、叶绿素含量、Pro含量以及SOD、POD和CAT活性均显著高于野生型拟南芥,而MDA含量则显著低于野生型拟南芥。【结论】BsMYB62基因通过提高转基因拟南芥的光合潜能和抗氧化能力,显著增强其对干旱胁迫的抗性。

狂犬病暴露后预防性单克隆抗体药物研究进展

简要介绍狂犬病的流行现状、发病机制、狂犬病病毒G蛋白中和抗原位点及其单克隆抗体的中和机制。重点介绍目前全球已上市或处于研发阶段的多种狂犬病病毒单克隆抗体药物的筛选发现技术、识别位点、作用方式以及体内外病毒中和效果,分析上述单克隆抗体在目前狂犬病暴露后治疗的应用推广中存在的问题,并针对当前狂犬病免疫球蛋白存在的血源供应、中和效价、质量控制及潜在病毒感染等问题,指出狂犬病病毒单克隆抗体研发的重要性,尤其是抗体的中和效价和中和广度,进而提出针对狂犬病病毒遗传谱系Ⅱ/Ⅲ的全人源单克隆抗体开发,以及针对G蛋白多个抗原位点的单克隆抗体鸡尾酒(mAb cocktail)疗法是当前在狂犬病暴露后预防性单克隆抗体药物研发中亟待解决的问题。

山羊AGRP基因克隆及在黑色素细胞中的表达研究

为了研究刺鼠相关蛋白(agouti-related protein,AGRP)基因在动物皮肤黑色素沉积中的作用,试验以酉州乌羊为研究对象,利用TRIzol法提取皮肤组织RNA,通过RT-PCR扩增AGRP基因编码区(coding region,CDS)序列,采用生物信息学软件预测AGRP蛋白质结构和功能,构建系统进化树分析山羊与其他哺乳动物AGRP基因的保守性;体外培养黑色素细胞,利用实时荧光定量PCR检测AGRP基因在细胞增殖和分化阶段不同时间点的相对表达量。结果表明:酉州乌羊AGRP基因CDS序列长度为405 bp,编码135个氨基酸,编码蛋白质分子量为14871.36 u,理论等电点为5.70;AGRP蛋白二级结构由3个α-螺旋和1个β-折叠以αααβ的顺序组成;AGRP蛋白的氨基酸序列在不同物种间高度相似;在构建的系统进化树中,酉州乌羊与绵羊和山羊的亲缘关系最近,与小鼠和人的亲缘关系最远。AGRP基因在黑色素细胞增殖和分化阶段的不同时间点均有表达,随着细胞培养时间的延长,AGRP基因的相对表达量在增殖阶段先逐渐降低再升高,在分化阶段逐渐升高,与0小时比较均差异极显著(P<0.01)。说明AGRP基因在黑色素细胞中具有时空特异性,在黑色素沉积过程中发挥重要作用。

不结球白菜BcCHC1蛋白参与调控TuMV侵染的初步研究

【目的】为增强不结球白菜对芜菁花叶病素养(TuMV)的抗性,研究探讨了不结球白菜中BcCHC1蛋白与TuMV之间的相互作用机制。【方法】首先从不结球白菜中鉴定出重链网格蛋白(CHC)基因家族的成员BcCHCs,随后克隆了1个代表性的CHC1基因,并对其进行了亚细胞定位分析。通过双分子荧光互补实验(BiFC)筛选出与BcCHC1蛋白相互作用的TuMV蛋白,并利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)来沉默BcCHC1基因,以评估其功能。【结果】(1)成功克隆了不结球白菜的BcCHC1基因,该基因的编码序列长5124碱基对,编码1708个氨基酸。(2)在TuMV感染不结球白菜30 d后,实时荧光定量PCR分析显示,感染TuMV的不结球白菜中BcCHC1基因的表达量显著降低。(3)亚细胞定位研究表明,BcCHC1蛋白主要定位于烟草表皮细胞的细胞膜和细胞核。(4)BiFC实验进一步证实,BcCHC1蛋白能够与TuMV的CI和6K2蛋白发生相互作用,其中与CI的互作主要发生在细胞核内,而与6K2的互作则主要位于细胞膜。(5)通过对BcCHC1基因沉默株系的观察发现,沉默BcCHC1基因会导致植株死亡。【结论】BcCHC1蛋白通过与TuMV的CI和6K2蛋白相互作用,影响网格蛋白依赖的内吞作用途径及病毒复制,从而调控TuMV对不结球白菜的侵染。然而,BcCHC1基因调控TuMV侵染不结球白菜的具体机制仍需进一步研究。

吡虫啉胁迫对红光熊蜂抗氧化酶系与解毒酶系的影响

为探究亚致死剂量吡虫啉胁迫对红光熊蜂工蜂的存活率、解毒酶活力与解毒基因表达量的影响,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆红光熊蜂工蜂(21日龄)解毒基因,检测其表达量变化与抗氧化酶的活性,并通过饲喂外源褪黑素以提高熊蜂的抗药性.结果表明:随着胁迫时间的延长,吡虫啉处理组(IMI组)存活率显著下降,但始终低于吡虫啉+褪黑素处理组(IMI+MT组);IMI组4种抗氧化酶的活性均随吡虫啉胁迫时间的延长呈先上升后下降的趋势,始终低于IMI+MT组;IMI组8种解毒基因的表达量除AChE,DDTase和GLD基因外,其余表达量均随吡虫啉胁迫时间的延长呈先激活后抑制的状态,且明显高于对照组(CK组)而低于IMI+MT组;IMI组DDTase基因的表达量与CK组差异不明显,但始终低于IMI+MT组,说明吡虫啉对DDTase的作用不明显,而褪黑素诱导DDTase表达效果较显著(P<0.05);IMI组AChE和GLD基因的表达量均低于CK组,随吡虫啉胁迫时间的延长而呈下降趋势,但IMI+MT组二者的表达量始终高于IMI组.短期亚致死剂量吡虫啉胁迫对红光熊蜂影响不显著,长期胁迫则影响其存活率,红光熊蜂对吡虫啉的代谢解毒是一个多酶系、多基因协同参与的理化过程,褪黑素可提高红光熊蜂的抗药性.

草莓FaWRKY70基因克隆与表达模式分析

【目的】WRKY是植物特异性转录因子家族之一,参与植物多种生命活动,但在草莓中鲜见WRKY70相关报道。深入解析WRKY70同源基因在草莓响应胁迫过程中的作用,加快分子育种技术应用,培育新草莓种质资源。【方法】用同源克隆法从‘红颜’草莓果实中克隆得到FaWRKY70基因,用生物信息学分析其保守结构域、理化性质、蛋白质结构及进化关系等,并结合qRT-PCR数据进行表达模式分析。【结果】FaWRKY70基因全长1020 bp,编码339个氨基酸;同源基因比对发现,FaWRKY70与苹果、牡丹等同科物种氨基酸序列相似度较高,且同源基因多与植物对生物、非生物胁迫响应相关,暗示FaWRKY70可能参与草莓抵御胁迫的过程;FaWRKY70在草莓不同器官中均有表达,且差异显著,在花中表达量最高,在果实中最低;水杨酸处理后,FaWRKY70基因快速响应,表达量在3 h后达到最高,随后逐渐降低;茉莉酸甲酯处理后FaWRKY70基因受诱导响应程度小,整体呈下调趋势。【结论】FaWRKY70能通过不同响应方式参与草莓生命活动及激素信号转导过程。

梅花鹿DLX5基因克隆及表达分析

为研究梅花鹿(Cervus nippon)DLX5基因的结构和功能,进一步探究其与梅花鹿茸角骨化机制间的关系,采用RT-PCR技术对梅花鹿DLX5基因进行克隆,获得包含全部编码区的c DNA序列,对该基因的氨基酸序列进行生物信息学分析并构建系统进化树,通过KEGG富集分析其信号通路,运用实时荧光定量RT-PCR检测该基因在鹿茸生长不同时期的表达情况。结果表明:梅花鹿DLX5基因编码区长为870 bp,共编码289个氨基酸。DLX5蛋白为可溶性的不稳定蛋白,有2个保守结构域,主要定位于细胞核。梅花鹿DLX5蛋白与许多不同物种来源的DLX5蛋白氨基酸序列有较高相似度,比较保守。DLX5蛋白二级结构中无规则卷曲占比最大(78.89%),其后依次是α-螺旋、延伸链,占比分别为16.96%和4.15%。DLX5基因主要的作用通路为TGFβ信号通路、MAPK信号通路和Wnt信号通路等。实时荧光定量RT-PCR结果表明,DLX5基因在鹿茸生长后期(三杈茸)表达量显著增高,这种上调表达暗示了其在鹿茸骨化过程中发挥重要作用,说明其可能是鹿茸骨化相关候选基因。

日本沼虾Bax基因克隆及其在低氧胁迫过程中的作用

为探究细胞凋亡相关基因Bax(B-cell lymphoma-2 associated X protein)在日本沼虾低氧胁迫过程中所发挥的作用,实验采用cDNA末端快速扩增(RACE)PCR技术获得日本沼虾细胞凋亡相关基因Bax的cDNA全长序列,采用半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR(qPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同低氧阶段的表达情况,同时采用Western blot与免疫组化分析了低氧下日本沼虾Bax蛋白的表达与定位。日本沼虾Bax基因cDNA全长2287 bp(NCBI登录号:MZ823353),包括5'非编码区(UTR)为42 bp,3'UTR为814 bp,开放阅读框(ORF)1431 bp,编码476个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾细胞凋亡基因Bax富含高度保守的BH1、BH2及BH3结构域。系统进化树分析显示,日本沼虾Bax基因与斑节对虾等甲壳动物Bax聚为一支,具有最近的亲缘关系。RT-PCR结果表明,日本沼虾Bax基因在肝胰腺中表达量最高,在脑中表达量最低。在低氧胁迫1~96 h时,日本沼虾鳃和肝胰腺组织Bax基因表达量均显著高于对照组,这与日本沼虾Bax蛋白表达丰度基本相似。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白Bax,并将纯化重组蛋白免疫兔子获得抗血清。免疫组化结果显示,鳃和肝胰腺Bax蛋白阳性信号主要定位在鳃上皮细胞和肝细胞中。最后,采用流式细胞仪分析表明,日本沼虾血细胞凋亡率在低氧胁迫96 h时显著高于对照组,这与日本沼虾Bax基因转录水平和蛋白表达丰度相吻合。研究表明,日本沼虾Bax基因在日本沼虾不同组织应答低氧胁迫分子过程中均具有促凋亡作用。本研究可为探明日本沼虾不耐低氧的分子机制提供理论参考。

基于简化基因组测序筛选白斑狗鱼耐热性状关联的InDel标记

为了能给白斑狗鱼耐高温性状的改良提供有效的分子标记,本研究基于白斑狗鱼热敏感组(109尾)和耐高温组(103尾)进行简化基因组测序,对25个染色体中的InDel标记,以前两个PCA为协变量,利用MLM模型(Masked Language Mode)与白斑狗鱼的耐热性状进行了关联分析。结果显示,大部分InDel分布在内含子(63.69%),外显子分布的InDel位点较少(1.30%)。通过GWAS分析,发现5个位点与白斑狗鱼耐热性状显著关联,分别位于safb基因、未知基因LOC117593903和CLSTN2基因内含子中。其中9N del、4N del-1和4N del-2三个InDel位点均位于CLSTN2基因第3内含子,这3个位点在212尾个体中基因型分布高度连锁。本研究中发现的5个InDel突变可能会对白斑狗鱼的耐热性状产生显著的影响,可作为白斑狗鱼耐热性状改良的候选分子标记。进一步在验证群体中利用KASP技术对部分位点进行了验证。发现9N del位点DD基因型个体在热敏感组中占优势,DI基因型个体在耐高温组中占优势,与简化基因组测序结果基本一致。位于CLSTN2基因第2内含子的3个InDel位点可能影响CLSTN2基因的转录,该基因可能是白斑狗鱼耐高温性状相关的重要候选基因。研究结果为白斑狗鱼分子标记辅助育种提供了理论依据,为白斑狗鱼耐热性状的改良提供了候选分子标记。

辣椒MADS-box转录因子CaRIN基因克隆、表达与功能分析

【目的】探究MADS-box家族基因RIN的表达特征和功能,解析其对辣椒类胡萝卜素代谢的影响。【方法】基于辣椒果实发育转录组,通过RT-PCR克隆辣椒MADS-box转录因子CaRIN基因CDS全长,分析其生物信息学、表达模式、亚细胞定位、转录活性等,并探讨VIGS诱导CaRIN基因沉默对类胡萝卜素代谢的影响。【结果】(1)CaRIN基因CDS全长732 bp,编码243个氨基酸,蛋白分子质量为27.95 kD,等电点(pI)为7.06,其编码蛋白具有典型的MEF2_like MADS结构域,属MICK型转录因子。(2)CaRIN基因主要在花和果实中表达,具有组织特异性;CaRIN定位在细胞核,并且具有转录激活活性。(3)CaRIN基因启动子具有ABRE等多个激素应答元件,外源脱落酸和乙烯利均能加速果实转红,诱导CaRIN及相关基因高表达。(4)VIGS诱导沉默CaRIN基因后,类胡萝卜素代谢途径基因PSY1、CCS、PDS、CRTZ、LCYB和NCED1表达水平降低为对照组的0.27~0.59倍,且果实总类胡萝卜素含量(0.379 mg/g)较对照(0.650 mg/g)显著降低。【结论】CaRIN是辣椒果实类胡萝卜素代谢过程的重要调控因子。

薄荷McZFP1基因克隆及表达分析

根据前期茉莉酸甲酯处理的薄荷(Mentha canadensis Linn.)转录组数据分析结果,从薄荷中克隆到McZFP1,并进行了基因和蛋白质特性、组织表达、非生物胁迫处理下的表达、亚细胞定位以及转录自激活活性分析。结果显示:薄荷McZFP1的开放阅读框长度为558 bp,编码185个氨基酸。McZFP1具亲水性,无跨膜结构域,属于不稳定蛋白,包含C2H2保守结构域,含有13个丝氨酸、3个酪氨酸和3个苏氨酸的磷酸化位点。进化树分析结果表明McZFP1与一串红(Salvia splendens Ker-Gawler)SsZFP7的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明:McZFP1在薄荷不定根、茎、根状茎、幼叶、成熟叶和花中均有表达,在根状茎中的相对表达量最高,且受150 mmol·L^(-1)NaCl、300 mmol·L^(-1)甘露醇、200μmol·L^(-1)脱落酸和200μmol·L^(-1)茉莉酸甲酯处理诱导表达。McZFP1定位于细胞核,无转录自激活活性。综上所述,薄荷McZFP1在不同组织中存在表达差异,参与调节激素和非生物胁迫响应过程。

蒲公英TmRAV1基因克隆及其响应脱落酸信号表达分析

根据脱落酸处理的蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)的转录组数据,在蒲公英中克隆获得1个编码RAV转录因子的基因序列,命名为TmRAV1。TmRAV1的开放阅读框(ORF)长度为1026 bp,编码342个氨基酸。TmRAV1的理论相对分子质量为38229,理论等电点为pI 9.20。TmRAV1为不稳定蛋白,具有亲水性,没有跨膜结构域和信号肽,含有44个磷酸化位点。氨基酸序列比对结果显示:TmRAV1与莴苣(Lactuca sativa Linn.)LsRAV1氨基酸序列的同源性最高(一致性为85.88%),具有高度保守的AP2和B3结构域。系统发育分析结果表明TmRAV1与其他5种植物的RAV转录因子聚在一起。TmRAV1在蒲公英叶中的相对表达量显著(P<0.05)高于根和花。TmRAV1受100μmol·L^(-1)脱落酸和250 mmol·L^(-1)NaCl的显著诱导。TmRAV1能够显著上调脱落酸敏感型转录因子基因TmAREB1的表达。TmRAV1是核定位转录因子,与脱落酸信号核心蛋白家族成员TmSnRK2.6互作。综上所述,蒲公英TmRAV1响应脱落酸等多种信号,其编码蛋白与TmSnRK2.6互作,并调控TmAREB1的表达。

黑莓1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因RuACO 1a和RuACO 1b的克隆及功能鉴定

基于前期黑莓(Rubus spp.)品种‘Navaho’果实转录组测序结果,通过反转录PCR克隆获得2个1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)基因,命名为RuACO 1a和RuACO 1b。结果表明:RuACO 1a和RuACO 1b的开放阅读框(ORF)长度分别为939和918 bp,分别含有4和3个外显子。系统进化分析结果显示RuACO1a和RuACO1b与月季(Rosa chinensis Jacq.)、蕨麻〔Argentina anserina(Linn.)Rydb.〕和野草莓(Fragaria vesca Linn.)ACO1蛋白的亲缘关系均较近,且分别属于蔷薇科(Rosaceae)植物中2类ACO1蛋白。RuACO 1a在果实着色后28 d响应乙烯利诱导,其相对表达量急剧升高,而RuACO 1b在果实着色后21 d响应乙烯利诱导,早于RuACO 1a。脱落酸处理后,RuACO 1a和RuACO 1b的相对表达量在果实着色后14和28 d较高。RuACO 1a和RuACO 1b具有组织表达特异性,RuACO 1a在幼果、花蕾和花中的相对表达量较高,RuACO 1b在幼果和幼根中的相对表达量较高。与野生型相比,RuACO 1a和RuACO 1b过量表达转基因拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕植株均表现为叶片中叶绿素相对含量和氮含量升高、开花和角果成熟提前、ACO含量升高。综上所述,黑莓RuACO 1a和RuACO 1b基因均促进拟南芥角果提前成熟。

苹果6-磷酸葡萄糖酸内酯酶基因MdPGL4的克隆及功能分析

6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)是氧化戊糖-磷酸途径的关键酶,在糖代谢以及植物免疫反应中发挥着重要作用。本研究基于前期转录组测序结果筛选出对轮纹病有强烈响应的基因MD01G1226300,并对该基因进行克隆鉴定与功能分析。结果表明,接种轮纹病菌6 d后,‘鲁丽’苹果的病斑面积显著小于其亲本‘皇家嘎啦’和‘藤牧1号’;qRT-PCR分析发现MD01G1226300被强烈诱导表达,但在‘鲁丽’中的表达水平显著低于‘皇家嘎啦’和‘藤牧1号’。生物信息学分析结果表明,MD01G1226300的cDNA全长762 bp,编码253个氨基酸,MD01G1226300蛋白相对分子量为28.04 kDa,理论等电点为5.85,为稳定的亲水性蛋白,属于SugarP_isomerase超家族,存在6个可能的活性位点,无跨膜结构域且整体位于膜外区,三级结构主要由α螺旋和β折叠形成;通过同源序列比对分析后命名为MdPGL4,与梨PbPGL4进化关系最近,氨基酸序列同源性为70.13%。超表达MdPGL4的转基因苹果愈伤组织对轮纹病的抗性以及抗性相关基因的表达水平显著低于对照,表明MdPGL4负调控苹果对轮纹病的抗性。本研究结果丰富了苹果中PGL家族基因响应生物胁迫的理论体系,为苹果抗病分子机制解析和通过遗传性状改良创制抗病苹果新种质提供了参考基因。

烟草磷转运蛋白基因NtPHT2;1克隆和表达分析

【目的】植物对磷酸盐的吸收与利用主要依靠磷转运蛋白,其中PHT2家族编码的低亲和磷转运蛋白主要负责植物在正常供磷条件下磷酸盐的吸收、转运与再利用,为了探究低亲和磷转运蛋白基因NtPHT2;1在烟草转运磷酸盐中的作用和表达模式,通过NtPHT2;1培育烟草磷素高效利用新品种。【方法】以普通烟草K326的cDNA为模板,克隆得到NtPHT2;1,对该基因进行生物信息学分析和蛋白质的亚细胞定位,并通过荧光定量PCR技术对该基因在低磷等非生物胁迫下的基因表达模式进行分析。【结果】(1)NtPHT2;1基因全长1764 bp,编码587个氨基酸;(2)亚细胞定位结果显示,NtPHT2;1蛋白定位于叶绿体上;(3)同源性比对发现,NtPHT2;1蛋白与辣椒CaPHT2;1蛋白的同源性最高达到91.00%;(4)NtPHT2;1启动子含有参与调控植物衰老、逆境胁迫相关的顺式作用元件;(5)NtPHT2;1在叶片表达量最高,新叶中的表达量比老叶中高;在低磷诱导条件下,该基因表达量与正常条件相比差异不显著;(6)非生物胁迫下的表达模式分析显示,NtPHT2;1基因表达量在盐胁迫和干旱胁迫下显著降低。【结论】NtPHT2;1基因主要是负责烟株正常生长发育条件下磷酸盐的转运与利用。

溶血相关基因缺失降低鳗弧菌感染花鲈的致病性

为阐明毒力因子溶血素对鳗弧菌感染花鲈过程中发挥的作用,实验以花鲈为研究对象,通过对花鲈幼鱼分别注射5.0×10^(5)CFU鳗弧菌野生株和缺失株△vah1-vah4-rtxA,评估了溶血相关基因缺失对花鲈的感染能力、花鲈各组织的病理变化情况以及免疫响应的影响。结果显示,花鲈感染野生株后的LD_(50)为2.103×10^(5)CFU/mL,感染缺失株△vah1-vah4-rtxA后LD_(50)为1.837×10^(6)CFU/mL,溶血相关基因缺失使鳗弧菌毒性降到原来的11.44%;鳗弧菌主要定植在花鲈的肠道和鳃中,溶血相关基因缺失降低鳗弧菌在花鲈体内的定植能力,同时降低对鳃和肠道的损伤程度;转录组分析表明vah1、vah4和rtxA缺失后,头肾组织的差异表达基因显著富集到造血细胞谱系、抗原处理和呈递、细胞黏附分子、肠道免疫网络的IgA生产等免疫通路,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对表达水平进行了验证。研究表明,溶血相关基因缺失降低了鳗弧菌感染花鲈的致病能力。研究结果有助于进一步了解鳗弧菌的致病机制,并为开发花鲈抗弧菌免疫增强剂或减毒疫苗提供依据。

调控葡萄酒石酸生物合成基因VvbHLH79克隆及表达

【目的】酒石酸不仅影响葡萄果实的味道,还决定葡萄酒的色泽、口感、微生物稳定性和陈酿潜力。探讨调控酒石酸生物合成的转录因子及其机制,通过生物技术调控葡萄内源酒石酸的积累或定向培育高酒石酸积累型优良酿酒葡萄品种具有重要价值。【方法】研究以酿酒葡萄‘琼瑶浆’、‘马瑟兰’为试验材料,用PCR方法从中克隆到与酒石酸含量相关的VvbHLH79转录因子,对其进行生物信息学和亚细胞定位分析;用HPLC和qRT-PCR技术测定葡萄果实在不同发育时期的酒石酸含量和VvbHLH79的表达量;并构建植物表达载体,用农杆菌介导的果梗侵染法瞬时转化葡萄幼果果实之后检测VvbHLH79的表达量和酒石酸含量。【结果】(1)通过RNA-seq测序筛选获得1个葡萄VvbHLH79基因,该基因CDS序列全长831 bp,编码277个氨基酸,分子质量为66.22 kD,理论等电点为5.15,属于无信号肽和跨膜结构的不稳定亲水性蛋白;氨基酸序列第147-232位含有bHLH-SF保守结构域,属于bHLH转录因子家族;亚细胞定位在细胞核。(2)葡萄VvbHLH79编码蛋白与河岸葡萄中的bHLH89编码蛋白(登录号:XP_034699340.1)序列一致性最高,达到99.64%。(3)VvbHLH79相对表达量随着‘琼瑶浆’果实发育降低,从坐果期到成熟期降低了67.25%;酒石酸积累主要在葡萄果实转色之前,转色之后酒石酸含量就快速下降。(4)VvbHLH79在低酒石酸葡萄果实中瞬时过表达后使酒石酸含量显著升高,而将VvbHLH79在高酒石酸葡萄果实中沉默后酒石酸含量显著下降,证实VvbHLH79基因正向调控酒石酸含量。【结论】VvbHLH79转录因子可能在葡萄酒石酸生物合成通路中发挥作用。

石蒜1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因LrACS的克隆及功能鉴定

为了解1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(ACS)基因在石蒜〔Lycoris radiata(L'Hér.)Herb.〕乙烯合成中的作用,对石蒜ACS基因LrACS进行了克隆,并通过系统进化树和氨基酸序列比对分析明确LrACS与其他同源蛋白的进化关系。利用亚细胞定位分析LrACS在细胞中的定位,对LrACS重组蛋白进行体外活性检测,并利用实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)分析不同生长时期LrACS的组织特异性表达。结果显示:LrACS的开放阅读框长度为1473 bp,编码490个氨基酸。LrACS的理论相对分子质量为54954.97,理论等电点为pI 8.21。系统进化树分析结果表明LrACS与忽地笑〔Lycoris aurea(L'Hér.)Herb.〕LaACS的亲缘关系最近,均属于Ⅰ型ACS蛋白。亚细胞定位结果显示LrACS主要定位于细胞质基质。体外活性检测结果证实LrACS重组蛋白能够催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)生成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)。qRT-PCR分析结果显示:LrACS在花期和叶期的石蒜各组织中均有表达,但其表达具有组织特异性,其中,花期花瓣中LrACS的相对表达量极显著(P<0.01)高于根、鳞茎、花茎,叶期根中LrACS的相对表达量极显著高于鳞茎和叶。综上所述,LrACS主要定位于细胞质基质并在石蒜不同生长时期行使催化SAM生成ACC的功能。

RcAGL61基因调控雄蕊和花瓣之间转变影响月季花瓣数量

[目的]为探究月季重瓣性状的调控机制,研究克隆了前期筛选到的1个与花发育相关的AG同源基因RcAGL61,并对其功能进行分析。[方法]用荧光定量对该基因在‘窄叶藤本月季花’ב月月粉’杂交群体中重瓣株系和单瓣株系花芽5个发育时期的表达模式进行分析,以重瓣株系和单瓣株系为材料,克隆RcAGL61,并进行生物信息学分析、亚细胞定位及VIGS实验。[结果](1)该基因表达水平在单瓣株系的5个发育时期均显著高于重瓣株系,在单瓣株系花发育的S4-S5期比S1-S3期表达量明显升高。(2)RcAGL61编码区序列在单瓣株系和重瓣株系中一致,长度为495 bp,与RcAG基因序列相似度为30.75%,编码164个氨基酸,含有1个MADS-box保守结构域,属于MADS-Box基因家族。(3)RcAGL61蛋白定位于烟草表皮细胞的细胞核。(4)沉默该基因后,瓣化雄蕊数量增加,雄蕊数量减少,花瓣数量增加,萼片数量和雌蕊数量无显著变化。[结论]RcAGL61参与调控雄蕊原基和花瓣原基间的转变,影响月季的花瓣数量。

紫丁香SoDXR基因克隆及其在单萜类物质合成中的功能分析

[目的]探究1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因在紫丁香单萜类物质合成中的作用,为紫丁香花香分子育种提供有效的基因资源和理论基础。[方法]以紫丁香花瓣为材料,克隆了SoDXR基因,并对其进行生物信息学和亚细胞定位分析、不同花发育时期和器官组织中的qRT-PCR表达分析以及探究其在金鱼草花瓣中异源瞬时过表达后的功能。[结果]SoDXR基因全长为1425 bp,编码474个氨基酸,编码的蛋白具有保守的DXP_reductoisom结构域,与桂花和油橄榄的相似性高达95%。亚细胞定位显示该蛋白主要定位于质体,与软件预测结果一致。伴随着开花,SoDXR表达水平呈先升高后降低的趋势,在初开期最高,其在各个器官组织中均有表达,花瓣中表达量最高,茎中表达量最低。瞬时过表达表明,SoDXR基因的表达水平显著高于对照,促进了主要单萜成分罗勒烯和月桂烯的释放,释放量分别增加了15.03倍和4.83倍。[结论]SoDXR基因正调控紫丁香单萜类物质的合成,表明DXR基因在花香次级代谢物合成中起到重要作用。