奶牛小肠上皮细胞系细胞染色体核型与G-带分析

为了鉴定奶牛小肠上皮细胞系(BIECs-21)的生物学遗传稳定性,体外贴壁培养BIECs-21细胞,制备染色体标本和G-带标本,分析BIECs-21细胞的染色体核型和G-带。结果表明:BIECs-21细胞染色体数为2n=60,包括常染色体29对和性染色体(X和Y染色体)1对。其中,29对常染色体均为端部着丝点染色体;性染色体中,X染色体是较大的中着丝粒染色体,Y染色体是较小的中着丝粒染色体。除X、Y性染色体外,BIECs-21细胞常染色体的G-带带纹的数量和位置无显著差异。BIECs-21细胞与荷斯坦牛的正常染色体核型相比,染色体数目及形态结构均没有明显变化,证明该细胞系遗传特性稳定,可以用于牛肠道相关疾病分子机制的研究。

三维细胞培养系统黏弹性成像:采用结构化边界和混响波理论

目的水凝胶作为一种合成细胞外基质被广泛用于三维细胞培养。其力学性能,在调控细胞行为方面发挥重要作用,且随细胞培养而发生改变。因此,有必要建立一种简单实用、无污染的黏弹性成像方法。本文将基于混响波理论,对培养皿内凝胶的黏弹性,进行非接触测量。方法基于混响波理论的黏弹性测量,首要条件是在凝胶中激发了近似完全混响位移场,通过在常规的培养皿内放置一结构化边界(最多含56个圆柱,圆柱直径约为1/3.6波长),用于散射弹性波,激发混响位移场,并通过互相关系数进行定量其混响程度。其次,对位移场进行傅里叶变换,得到特征频率混响位移场。最后,对此位移场进行自相关计算,并拟合混响波理论计算波速和黏弹性。以上方法将在有限元模拟和实验中进行验证。结果有限元模拟结果显示,结构化边界中的散射体越多,互相关系数越小,位移场的混响程度越高,且理论反演的波速吻合有限元参数设定。分别对4%v/v,5%v/v,and 6%v/v浓度的凝胶进行黏弹性测量,并对其进行剪切流变仪测量,两种方法得到的剪切波波速一致。结论成功建立了一种基于混响波理论的黏弹性测量方法,下一步将进行细胞三维培养的力学生物学实验,进一步验证本方法的实用价值。

猪腹膜间皮细胞的分离培养及初步应用

本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学、免疫学方法鉴定细胞。使用Mhr感染PMC细胞,观察细胞形态变化,并利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法检测细胞活性损伤情况。结果显示,倒置相差显微镜观察显示,分离培养的细胞早期呈拉网状,5~8 d后生长可达融合状态,细胞大小均一,呈多边形铺路石状;间接免疫荧光试验结果显示,细胞波形蛋白、角蛋白-18抗原呈阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原呈阴性;扫描电镜下可见细胞表面微绒毛。结果证实分离培养的细胞为猪PMC细胞,纯度达95%以上。Mhr感染后,光镜下可观察到细胞发生明显皱缩,感染组细胞的LDH释放量较对照组细胞显著升高。本研究成功建立了猪原代PMC细胞的分离培养方法,并初步用于Mhr体外感染,为研究Mhr等引起浆膜炎的病原与宿主的互作机制提供了体外细胞模型。

智能水平旋转式细胞培养装置设计

目的:研制一种模块化、操作简单、易消毒、成本低、稳定性高的智能水平旋转式细胞培养装置,以用于管状支架内表面的细胞三维动态培养。方法:该装置由旋转培养模块、驱动模块、控制模块和控制软件组成,每个模块的外壳均由3D打印制作。其中,旋转培养模块由管状静电纺丝支架、细胞培养仓、磁耦合转子、聚丙烯管道等组成;驱动模块由N20减速电机、磁耦合转子组成;控制模块由ESP-8266芯片及印刷电路板组成;控制软件通过Blinker物联网平台开发,采用C++语言编程。采用该装置培养人肝内胆管上皮细胞,验证该装置的应用效果。结果:光镜和扫描电子显微镜图像显示,在管状静电纺丝支架表面形成了均匀连续的细胞层。结论:该智能水平旋转式细胞培养装置可实现管状静电纺丝支架内表面细胞的均匀生长,为管状支架上的细胞培养提供了有效平台。

体外诱导间充质干细胞向成纤维细胞分化的研究

成纤维细胞(Fibroblast,FB)在美容医学和再生医学中展现出前所未有的潜力,然而成纤维细胞的获取以及数量有限是限制其临床应用的瓶颈。使用实验室自主设计的成纤维细胞诱导分化培养基DFM诱导间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)向成纤维细胞分化,并以诱导后的总细胞扩增倍数、成纤维细胞相关基因和蛋白的表达以及细胞的迁移能力为指标,建立了一个全面的分化效果评价体系。结果表明:成纤维细胞诱导分化培养基DFM中细胞的累计扩增倍数显著高于对照组;成纤维细胞相关基因和蛋白的表达显著高于对照组;细胞迁移能力也较对照组有显著提升。

MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感疫苗研究与生产中的应用进展

流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段。MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产。随着对流感病毒研究的不断深入,为了进一步拓展MDCK细胞用于流感病毒研究和工业应用的能力,研究人员开始发展MDCK细胞无血清全悬浮培养技术。通过长期的培养和优化,驯化的MDCK悬浮细胞株可以更好地适应流感病毒的生长环境,提高流感病毒的产量和感染性。总之,MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感病毒研究和工业应用中发挥着重要作用,为流感疫苗生产和抗流感药物研发提供更好的工具。同时也必须重视MDCK细胞的安全性,采取合适的措施来确保其应用的安全性和可靠性。

聚合物纤维载体对L929细胞的增殖及毒性研究

研究了进口聚合物纤维载体(1#)与国产聚合物纤维载体(2#和3#)对L929细胞增殖与毒性的影响。用CCK-8法在不同浸提液含量、不同培养时间下检测L929细胞在聚合物纤维载体中的相对增殖率。按通用标准评价材料的细胞毒性,并对载体表面和内部的细胞黏附性进行表征。结果表明:浸提液质量分数在6.25%~100.00%时,1#组、2#组、3#组均没有潜在细胞毒性,1#组、2#组、3#组的细胞毒性级别分别为“1”“0”和“1”级。体外细胞培养试验表明:在24 h的培养时间内,2#组、3#组的细胞增殖率和1#组基本接近;48~72 h的培养时间内,2#组、3#组的细胞增殖率略低于1#组。细胞黏附试验表明:2#组、3#组的细胞增殖率高于1#组,且细胞倾向于在纤维载体的内部生长。国产聚合物纤维载体的生物相容性、细胞毒性以及细胞黏附性均达到理想效果,其中3#组聚合物纤维载体的细胞增殖和细胞黏附效果最理想。

诱导人脂肪干细胞分化为胰岛素分泌细胞:三种不同诱导分化方案的比较

目的将脂肪干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞是糖尿病治疗的新策略。目前已报道的诱导分化方案效率差异较大。本研究拟对三种诱导分化方案的分化效率进行比较。方法将第三代脂肪干细胞自聚集成微球,使用三种诱导分化方案(一步诱导法、两步诱导法、三步诱导法)。采用PCR和免疫荧光检测三种方案中关键基因和蛋白的表达水平,通过葡萄糖刺激胰岛素分泌实验检测终产物的功能。结果对比三种方案,三步诱导法诱导出的胰岛素分泌细胞其关键转录因子INS、NKX6.1、PDX1的基因表达量明显增加。关键蛋白C肽和NKX6.1/PDX1在胰岛素分泌细胞中共表达。三步诱导法能显著提高产物的胰岛素分泌量。结论在相同条件下,三步诱导法的分化效率优于其他两种方案。本研究为建立高效、安全的胰岛素分泌细胞诱导分化方案提供了依据。

脂肪间充质干细胞经超声刺激后分泌的细胞外囊泡对脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

目的通过超声刺激脂肪间充质干细胞后,收集其分泌的细胞外囊泡,与正常脂肪间充质干细胞分泌的细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)进行比较,探究经超声刺激后分泌的细胞外囊泡对脂肪间充质干细胞生物学特性(包括细胞增殖、细胞迁移和成脂分化能力)的影响。方法首先,通过低强度超声处理部分脂肪间充质干细胞,收集细胞培养上清并采用超滤法提取细胞外囊泡(U-EVs),部分间充质干细胞正常培养,并收集其细胞外囊泡(N-EVs)。在不同浓度细胞外囊泡处理下对脂肪间充质干细胞进行CCK-8实验检测细胞活力,选取提升细胞活力的最佳浓度,在这一浓度下采用划痕实验检测细胞迁移,EdU法检测细胞增殖,并使用成脂诱导培养基诱导并比较脂肪间充质干细胞成脂分化能力。结果超声刺激后产生的细胞外囊泡符合国际外囊泡协会的鉴定标准,对脂肪间充质干细胞作用的最适浓度约为150μg/mL。在这一浓度下,U-EVs的细胞增殖率(19.2%±1.8%)显著高于N-EVs(11.9%±3.4%),并且U-EVs组的油红O染色面积是对照组的(2.78±0.23)倍,显著高于N-EVs组的(2.11±0.18)倍,但N-EVs组(16.3%±2.0%)和U-EVs组(21.5%±2.3%)的细胞迁移率没有显著差异。结论经超声刺激的脂肪间充质干细胞分泌的细胞外囊泡显著促进脂肪间充质干细胞的活力,提高细胞增殖、迁移和成脂分化的能力。

植物纤维对MS培养液中烟酸和维生素B_(6)的水平浸润传质效应

为筛选用于所发明帘状锚固培养生物反应器培养床的纤维,模拟反应器通过纤维丝将培养液浸润传质到愈伤组织细胞的流程创制了“纤维水平浸润传质模拟装置”,结合改进的烟酸、维生素B6、维生素B1 HPLC同步检测法,流动相洗脱体系采用庚烷磺酸钠溶液∶乙腈=90∶10(V∶V)等度洗脱等,研究16种纤维集束对MS培养液中烟酸、维生素B6和维生素B1的水平浸润传质效应。结果表明,16种纤维集束水平浸润传质具有升降MS培养液中烟酸、维生素B6浓度的效应,但效应持续时间均不超过84 min,且具有较明显种类间差异,秸秆和木材纤维的作用效应弱于茎皮和竹材纤维。慈竹、青皮竹竹材纤维集束中烟酸浓度的升降较明显,在0.02~2.58μg/mL,苎麻茎皮纤维集束中烟酸浓度的升幅最高,达3.17μg/mL,是原浓度的5倍多,持续时间72 min。青皮竹、毛竹竹材纤维集束传质液中维生素B6的浓度出现下降至零点的效应,苎麻茎皮纤维集束中出现较原浓度升高2倍的高点,其他种类纤维集束中3种维生素的浓度升降较小。虽然植物纤维集束会导致传质液中3种维生素的浓度升高或降低,但作用效应的持续时间均只在纤维集束饱和吸液后的84 min内。

电纺膜微观形貌对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

目前,材料物理因素对细胞的影响是研究热点之一。相关研究显示,静电纺丝所制备的支架材料所具有的微观形貌显著影响骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)在其上的生物学行为,这些形貌因素包括纤维直径、纤维排列方式、孔径与孔隙率等。本综述着重讨论了静电纺丝支架材料的微观形貌因素对BMSC生物学行为的影响,以期为静电纺丝支架材料的物理因素设计提供参考。

三维细胞培养在青光眼研究中的应用

神经节细胞(retina ganglion cells,RGCs)的退行性改变,对全球经济和健康造成了重大影响。其病理变化的分子及生物机制尚不明确,目前青光眼手术和药物治疗仍然局限于将眼压控制在正常范围。小梁网作为房水排出的重要途径,是眼压控制的关键一环。眼压改变引起的视网膜退行性改变是青光眼重要病理过程之一。小梁网及视网膜的体外模型构建是研究青光眼发生发展的主要研究方法。三维培养技术可以使细胞在体外形成一定的空间结构,有利于细胞-细胞及细胞-环境的相互作用,相比传统二维培养,三维培养更加接近体内细胞的生理环境,对于研究疾病的病理生理变化及高通量药物筛选具有重要意义,同时,三维培养更有利于对细胞空间构象变化及其力学性质改变进行研究。三维打印等新技术也在三维细胞培养中有所应用,为三维定制化培养提供技术基础。文章综述了小梁网及视网膜细胞三维培养在青光眼基础研究中的应用研究进展,旨在为进一步探究青光眼病理生理机制提供新的思路。

外泌体提取及提高外泌体产量研究进展

外泌体是由细胞分泌的一种细胞外囊泡亚型的生物聚合物,参与一系列生理和病理反应,临床应用前景极具潜力。外泌体来源广泛,几乎所有细胞均可分泌。但由于外泌体体积小、密度低,目前暂无公认的方法能够同时实现外泌体快速、高效、高纯度、无损伤的提取,导致产量低下,限制了临床应用,因此高效获得外泌体,提高外泌体产量对推动外泌体的临床应用尤为重要。具有脂质双分子层的脂质体利用其与外泌体结构相似的特性,能够在一定程度上提高外泌体的产量,故本文针对外泌体形成过程的各个阶段,对提高外泌体产量的方法进行综述。

二维和三维培养脐带间充质干细胞的差异基因表达研究

目的比较二维培养和三维培养的脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的细胞形态和基因表达。方法分别采用以聚氟乙烯为支架的三维培养及传统二维培养方法进行稳定增殖期UC-MSCs细胞的培养,使用倒置显微镜、扫描电镜等观察比较二维培养与三维培养在细胞形态、细胞连接等方面的不同;然后应用基因表达谱芯片技术检测二维培养细胞与三维培养细胞的差异表达基因,用KEGG数据库及GO数据库进行生物信息学分析。结果成功分离并培养人UC-MSCs,流式检测高表达CD105、CD73和CD90等。三维培养的UC-MSCs附着在支架的表面生长并向外扩散,支架各层均可见细胞生长,细胞与细胞间连接紧密。基因表达谱芯片分析显示,三维培养的UC-MSCs与二维培养的UC-MSCs相比,升高的基因主要与生物学过程、分子功能及细胞组分相关,且参与了多个细胞信号通路的调控。结论与二维培养相比,三维细胞培养环境更适合脐带间充质干细胞的生长。

煤矿设备智能化管理系统研究

文章针对煤矿设备管理中存在条理不清的问题,构建设备从采购到报废的全生命周期管理台账。借助深度学习算法,对煤矿业务流程中产生的设备数据进行分析预测,为管理者提供决策支持。通过工作流审批机制,实现设备全生命周期管理过程中的动态审批。基于云计算环境,实现智能化管理系统审批工作流任务的最优调度安排。最后通过微服务架构,建立了智能化煤矿管理系统稳定运行体系。

基于GelMA水凝胶的三维培养对肺癌细胞干性的影响及机理研究

目的利用甲基丙烯酸酐化明胶(gelatin methacryloyl,Gel MA)水凝胶构建三维(three-dimensional,3D)培养体系,研究其对肺癌细胞干性维持的作用及分子机制。方法通过光交联固化方法制备Gel MA水凝胶;利用目视比色法和RT-PCR验证其营造低氧、酸性微环境的能力;通过万能材料试验机检测力学特性;利用CCK-8和Calcein/PI进行细胞活性检测;通过检测肿瘤克隆形成、药物响应以及干性标志基因表达等确定基于Gel MA水凝胶的3D培养对A549细胞干性的影响;利用生物信息学的手段挖掘调节A549细胞干性维持的关键基因和代谢通路,并进一步通过RT-PCR和Western blot实验进行验证。结果Gel MA水凝可用于构建一种适合肿瘤细胞生长的低氧、酸性和力学硬度适当的3D细胞培养体系。在该体系下,A549细胞耐药性和克隆形成能力增强,干性标志基因表达增加。通过生物信息学手段发现,IL6、IL8和CCL2基因在A549细胞干性维持中起着重要调节作用,进一步在细胞水平进行验证,结果证实基于Gel MA水凝胶的3D培养对A549细胞IL6、IL8和CCL2基因的表达具有显著上调作用,并可显著抑制MAPKs信号通路。结论基于Gel MA水凝胶构建的3D细胞培养体系有利于肺癌细胞的生长和干性维持,而MAPKs信号通路的抑制可能在这一过程中发挥重要作用。

基于冰晶模板的凝胶孔径调控及在细胞三维培养中的应用

目的水凝胶是由水溶性聚合物通过物理或化学交联形成的仿生细胞外基质的三维网络,是理想的细胞三维培养支架。但传统水凝胶的有效孔径在10 nm~10μm范围,不利于细胞增殖、分化。为解决这一问题,本课题通过引入冷冻保护剂对冰晶生长进行调控制备有效孔径10μm以上的大孔水凝胶。方法通过在双键改性的明胶体系中引入具有各向异性电荷的纳米黏土,采用冷冻自由基聚合-冰晶模板法构建具有连通大孔结构以及水诱导形变恢复的多孔水凝胶;系统研究其溶胀性能、原位孔尺寸、力学性能,并优选具有形变恢复性能的多孔水凝胶用于骨髓间充质干细胞(BMSCs)三维培养。结果随着DMSO的体积分数从0%增大到15%,所构建的大孔水凝胶孔径从110±11μm减小至32±4μm;水凝胶的溶胀降低至31.1;没有加入DMSO溶液所制备的大孔水凝胶的压缩模量为4.0±0.1 kPa,引入1%、3%、5%的DMSO压缩模量分别为3.7±0.3 kPa、3.9±0.2 kPa、4.0±0.2 kPa;将BMSCs接种到不同孔径复合水凝胶中,培养1天时能够看到大孔水凝胶支架有利于BMSCs的黏附,培养3天后,BMSCs形态与成骨细胞相似。结论本课题制备的大孔水凝胶具有连通的孔结构以及良好的水诱导形变恢复性能,可用于细胞三维培养,有望应用于组织工程支架材料领域。

Current status and challenges for cell-cultured milk technology: a systematic review

Cellular agriculture is an innovative technology for manufacturing sustainable agricultural products as an alternative to traditional agriculture.While most cellular agriculture is predominantly centered on the production of cultured meat,there is a growing demand for an understanding of the production techniques involved in dairy products within cellular agriculture.This review focuses on the current status of cellular agriculture in the dairy sector and technical challenges for cell-cultured milk production.Cellular agriculture technology in the dairy sector has been classified into fermentation-based and animal cell culture-based cellular agriculture.Currently,various companies synthesize milk components through precision fermentation technology.Nevertheless,several startup companies are pursuing animal cell-based technology,driven by public concerns regarding genetically modified organisms in precision fermentation technology.Hence,this review offers an up-to-date exploration of animal cell-based cellular agriculture to produce milk components,specifically emphasizing the structural,functional,and productive aspects of mammary epithelial cells,providing new information for industry and academia.

固定床式生物反应器在293T细胞高密度培养中的应用

目的:研究悬浮和贴壁293T细胞在生物反应器内的高密度培养工艺。方法:分别在2个3.5 L固定床生物反应器中加入150 g片状载体,接种贴壁293T细胞和驯化为悬浮的293T细胞,根据葡萄糖消耗情况调整灌流量进行连续灌流培养6天。结果:贴壁293T细胞和悬浮293T细胞均能在固定床生物反应器片状载体上生长,细胞密度最终分别达到2.5×10^(7)cells/mL和2.3×10^(7)cells/mL,6天增殖约50倍。结论:固定床式生物反应可以用于贴壁和悬浮293T细胞的高密度培养。

长期传代人脐带间充质干细胞的特性及功能

目的:探讨传至10代(P10)的人脐带来源间充质干细胞(P10-hUC-MSC)的生物学特性及功能。方法:人脐带来源于厦门弘爱医院(伦理批号:HAXM-MEC-20201012-037-01),分离、收集、培养hUC-MSC并传代培养,收集P1-、P10-hUC-MSC,FCM检测hUC-MSC表型,细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法及FCM法检测终末期细胞衰老与凋亡情况,秋水仙碱处理检测细胞染色体稳定性,体外成脂、成骨诱导实验检测其多向分化能力,以不同比例与外周血单个核细胞(PBMC)混合培养后FCM检测T细胞亚群及表型变化。结果:成功分离和培养的P10-hUC-MSC与P1-hUC-MSC的表型相似,表现为CD45、CD34、HLA-DR表达阴性而CD105、CD90阳性率≥95%。终末期的P1-hUC-MSC和P10-hUC-MSC均表现出β-半乳糖苷酶表达阳性和早期凋亡特征,细胞染色体核型一致且保持稳定,未发生转化现象。P1-、P10-hUC-MSC在体外都可被诱导分化成脂肪、成骨细胞。P10-hUC-MSC与PBMC以1∶1混合培养7 d后,可显著上调CD4^(+)/CD8^(+)T细胞比值、CD4^(+)Treg细胞比例和PD-1表达(均P<0.01)。结论:长期传代的P10-hUC-MSC仍然保持其生物学特性和安全性,并具备多向分化能力及免疫调节能力,这为最大限度发挥hUC-MSC的临床放疗损伤修复与预防作用提供了前期实验依据和指导。