体细胞核移植技术及应用

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)是一种能使已分化的体细胞获得全能性(totipotency)的技术,在发育生物学、生物医学研究和农业应用方面具有重要价值。该技术主要包括卵细胞去核和核供体细胞植入两个环节。文章综述了SCNT技术的原理、流程、应用等,以期为SCNT技术的研究与应用提供参考依据。

影响小鼠体细胞脂质体法转染效率的因素

本实验主要研究脂质体量、质粒量、细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间、细胞传代次数以及细胞种类对转基因效率的影响.首先研究了脂质体量、质粒量和细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间对小鼠胎儿成纤维细胞(MFFC)的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响.结果表明,在本实验条件下,用传至3代的MFFC,24孔培养板中每孔接种4-10×104个细胞,70%-90%贴满程度,当脂质体(LipofectAMINE)4μg、质粒(pEGFP-N1)0.3μg,复合物作用时间为6h时获得的转染效率最高,为30.7%.用此方案比较不同传代次数的MFFC转染效率结果表明,原代细胞的转染效率为10.0%,3代为28.9%,到15代降到7.2%.说明随着传代次数的增加,转染效率逐渐降低.将MFFC、小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和小鼠颗粒细胞(MGC)分别传至3代,采用上述方案进行转染,转染效率分别是27.8%、13.7%和14.2%.可见不同种类细胞的转染效率不同.细胞周期检测表明,无论是不同代次的细胞还是不同种类的细胞,其转染效率高低与M期所占比例的多少有关.这为如何提高转染效率提供了有利的依据.

骨髓间质干细胞与胚胎嗅鞘细胞联合移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

目的:观察人骨髓间质干细胞(MSCs)与胚胎嗅鞘细胞(OECs)联合移植治疗大鼠脊髓损伤的效果,探讨共移植的OECs对MSCs分化的影响。方法:采用Allen's法制作大鼠脊髓损伤模型,随机分为MSCs移植组(A组)、OECs移植组(B组)、MSCs与OECs联合移植组(C组)及PBS注射组(D组),术后1～5周采用BBB评分、经颅磁刺激运动诱发电位及组织学方法检查脊髓损伤修复情况。结果:术后2周起,A、B、C组BBB评分和诱发电位潜伏期与D组比较恢复明显,C组与A、B组相比亦有显著性差异(P<0.05)。术后5周时C组损伤区有较密的神经轴突分布,近端可见大量成束再生轴突;A、B组损伤区及近端再生轴突分布稀疏;D组损伤区及近端少见轴突。C组移植的MSCs中Nestin及NF表达阳性的比率较A组高(P<0.05)。结论:联合移植OECs可促进MSCs向神经元方向转化,提高MSCs分化为神经元的比例;MSCs与OECs可以在脊髓损伤修复中发挥协同作用,联合细胞移植是提高脊髓损伤修复效果的可行方法。

细胞松弛素B浓度对小鼠卵母细胞去核效果的影响

目的 探讨细胞松弛素 B浓度对小鼠卵母细胞去核效果的影响。方法 常规超排 KM小鼠获卵母细胞 ,将有明显第一极体的卵母细胞放入含有 5× 10 - 3、1× 10 - 2 、2× 10 - 2 g/ L CB的成熟培养液中孵育 15 min,采用盲吸法去核 ,去核后的卵母细胞放入含 5× 10 - 3g/ L Hoechst33342的成熟培养液中染色 15 min,在荧光显微镜下检查去核的效率。结果 CB组去核率可达 88.2 % ,而对照组去核成功率仅达 2 9.7% ,两者的去核效果统计学上有显著差异 ;同时 CB的浓度过高会影响去核的效果 ,使卵母细胞的破溃率升高。结论 CB有利于去核 ,同时卵胞膜可以借助磷脂双层的游动性而很快得到修复 ;高浓度的 CB对卵胞膜作用过于强烈 ,细胞骨架严重破坏 ,磷脂双层结构的弹性和粘性减弱 ,修复能力降低 ,影响胚胎的构建。

经冠脉移植自体骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死后心功能的影响

目的 研究骨髓间充质干细胞 (MSC)植入幼猪急性心肌梗死 (AMI)区对心肌灌注及心功能的影响。方法 通过冠脉转运方法 ,将 5 溴脱氧尿嘧啶 (BrdU)标记的幼猪自体骨髓MSC植入心肌梗死区 ,8周后行99mTc MIBI门控心肌灌注显像评价心肌灌注及心功能的变化。结果 移植的MSC可通过毛细血管内膜并转化为心肌样细胞 ;8周后移植的MSC在心肌内微环境诱导下可心肌化及血管化 ;治疗组射血分数明显提高 (32 75 %vs4 9 86 % ,P <0 0 0 1)。结论 MSC移植通过促进血管及心肌再生 。

骨髓间充质干细胞移植对小型猪急性心肌梗死模型治疗作用的初步研究

目的 观察自体骨髓间充质干细胞 (MSC)心肌内移植对小型猪急性心肌梗死 (AMI)的治疗效果。方法 30只小型猪制备AMI模型 ,实验组 2 2只取骨髓分离MSC ,体外培养扩增后注入至缺血坏死心肌周围 ,对照组 8只输注等量生理盐水 ,1个月后比较两组的生存率、存活心肌来源和功能性蛋白质的表达。结果 实验组存活率 10 0 % ,存活心肌增加并检测到 5 溴脱氧尿嘧啶 (Br dU)标记物 ,心肌钙蛋白Ⅰ (cTnⅠ )等心肌功能性蛋白质的表达。结论 AMI小型猪自体骨髓MSC心肌内移植后 ,梗死区出现MSC来源的新生心肌 。

奶山羊转基因供核细胞的再饥饿对核移植胚胎发育的影响

为提高转基因奶山羊体细胞核移植胚胎早期发育率,将经转染外源基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿培养(含0.5%FCS的DMEM)5天后分成两部分:第一部分细胞-80℃或液氮冻存,试验前复苏后直接用作供核细胞(试验组Ⅰ),或复苏后恢复培养(含10% FCS的DMEM)2-5天后再饥饿5天用作供核细胞(试验组Ⅱ);第二部分细胞作传代培养(含10% FCS的DMEM)2天后再饥饿5 天用作供核细胞(试验组Ⅲ)。将上述不同处理的供核细胞进行细胞周期与存活率的检测,并将该供核细胞移入去除遗传物质的山羊MⅡ期卵母细胞的卵周隙内,经电融合、化学激活后,将核移植(NT)胚胎经0.8%琼脂糖包理后移入临时寄母输卵管内,培养6天后回收并观察NT胚胎的早期发育。结果,试验组Ⅱ所用供核细胞中G_0/G_1期细胞所占比例及其存活率分别为95.68%、99.9%,均显著地高于试验组Ⅰ(88.66%、80%);试验组Ⅱ的桑椹及囊胚期NT胚胎的发育率(66.09%)显著地高于试验组Ⅰ(22.00%)与试验组Ⅲ(50.51%)。将以上发育的NT胚胎分别移入同步发情的受体后,35 天作B超妊娠诊断,试验组Ⅱ的受体妊娠率为45.83%,显著地高于试验组Ⅰ(20.00%)与试验组Ⅲ(9.58%)。流式细胞仪分析结果表明,饥饿后的供核细胞经冷冻,复苏后恢复培养2-5天,再经饥饿处理,能显著地提高G_0/G_1期细胞的比例及细胞存活率;应用该细胞所组建的NT胚不仅具有较高的桑椹与囊胚期发育率,而且具有较高的受体妊娠率。

鱼类细胞核移植研究进展及前景展望

细胞核移植技术是目前生物技术领域研究的热点之一,其科学意义和应用价值重大。本文介绍了中国和世界上鱼类细胞核移植的研究成果及其最新进展;综述了鱼类细胞核移植的基本程序、方法和影响因素,包括胞质受体的准备、核供体的制备、核移植和核质杂种的培养。并对鱼类细胞核移植的应用、现存问题及应用前景进行了讨论。

大鼠局灶性脑缺血后神经前体细胞增殖迁移的研究

目的研究成年大鼠内源性神经前体细胞在局灶性脑缺血后不同时间窗的增殖分化情况。方法用Longa线栓法制作大鼠脑缺血模型,用免疫组化的方法检测大鼠内源性神经前体细胞最佳增殖时间及最大增殖效果。结果脑缺血半球室管膜下区、嗅球和头端迁徙渠道(rostralmigratorystream,RMS)Brdu阳性细胞数在脑缺血后1d明显增多,3～7d达高峰,14d后开始下降;Brdu阳性细胞数在脑缺血半球室管膜下区和嗅球成正相关;脑缺血侧海马齿状回未见Brdu阳性细胞数明显增多;Brdu阳性细胞在脑缺血后第3周数量最大,从第4周开始下降。结论成年大鼠局灶性脑缺血后3～7d内源性神经前体细胞增殖达高峰,在该期进行外源性细胞移植治疗可能更有效。

移植维甲酸诱导的人胚神经干细胞在受损大鼠脊髓内的分化及作用

目的 将维甲酸 (RA)诱导的人胚神经干细胞移植入受损的大鼠脊髓内 ,观察大鼠后肢运动功能的变化及细胞的分化情况。方法 实验大鼠 30只遭受脊髓中度损伤后 7天作移植治疗 ,实验组分两组 :一组移植经维甲酸诱导后的细胞 ,另一组移植未诱导的细胞 ;对照组注射等量PBS液。每周一次观察大鼠后肢运动情况 ,移植后 4周 ,应用免疫组化技术检测移植细胞在大鼠脊髓内的生存和分化情况。结果 实验组大鼠脊髓内见许多移植细胞存在 ,部分可分化出神经元样细胞 ,其后肢运动功能优于对照组。其中维甲酸诱导组能分化出神经元样细胞 ,其促进脊髓功能恢复的能力较另一组更强。结论 维甲酸预处理的神经干细胞在体内能替代缺失的神经细胞 ,促进受损的脊髓功能恢复 ,在脊髓损伤的临床治疗中具有潜在的应用价值。

蛛网膜下腔灌注胶质细胞源性神经营养因子对损伤脊髓再生及功能恢复的影响

目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对大鼠脊髓完全性横断后脊髓再生及功能恢复的影响。方法:采用大鼠胸段(T7～T8)脊髓完全横切损伤模型,将SD雌性大鼠随机分为正常组(n=6)、假手术组(n=6)、单纯横断组(n=10)、GDNF治疗组(n=10)。于大鼠脊髓损伤术后不同时间点进行行为学评估。24周时行生物素葡聚糖胺(BDA)顺行示踪处理,取材前行电生理检测。所取脊髓标本作神经中丝(NF-200)、生长相关肽-43(GAP-43)、胶质原纤维生长蛋白(GFAP)免疫组化检查,并应用图像分析系统进行定量分析。结果:行为学评分表明,3周后,GDNF组好于单纯横断组(P<0.05),术后24周,GDNF组和单纯脊髓横断组中均未记录到SEP波形,BDA示踪也未见伤区及远段蓝染的神经纤维,但GDNF组空泡样变较单纯横断组轻。免疫组化图像分析GDNF组的NF-200和GAP-43染色结果与单纯横断组间无统计学差异(P>0.05);但GDNF组GFAP染色明显弱于单纯横断组(P<0.05)。结论:GDNF能一定程度上改善脊髓损伤区及两端的神经细胞功能,但没有功能意义上的神经纤维再生。

椎间盘组织工程支架材料的研究进展

椎间盘退变性疾病是现代社会中一种常见病和多发病,其中以椎间盘突出症最为常见,是引起腰腿痛的常见病因,严重影响患者生活质量[1]。组织工程修复椎间盘退行性变是近年来脊柱外科领域基础研究的热点,

静脉移植骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤后轴突再生的作用

目的:研究静脉移植骨髓间充质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSC)对脊髓损伤后轴突再生的影响。方法:体外分离、培养、扩增、纯化、BrdU标记10只同种异体SD大鼠的BMSC,WD法制成完全性截瘫的同种大鼠脊髓损伤动物模型。制模后7d随机分为A、B、C三组,A组22只,作为BMSC移植组,经鼠尾静脉移植2×106/ml的BMSC悬液1ml;B组22只,作为对照组,移植1mlL-DMEM液;C组22只,作为空白手术对照组。移植后1、2、3、4、5、6周用BBB评分评估各组后肢运动功能;移植后2、3、6周组织学及免疫组织化学观察并检测损伤段脊髓内生长相关蛋白-43(growth-associatedprotein-43,GAP-43)、神经丝蛋白200(neurofilament-200,NF200)的表达。结果:移植后3周开始,A组的BBB评分在各观察时间点明显高于B组、C组,移植后6周维持在较稳定水平,而B、C组在伤后3周开始维持在较稳定水平;在移植后2、3、6周,A组GAP-43、NF200的表达明显高于高于B组、C组,6周时开始下降,而B组与C组在移植后2、3、6周的表达均维持在相对恒定的水平。结论:大鼠脊髓损伤后静脉移植BMSC能使损伤段脊髓GAP-43、NF200表达上调,促进脊髓损伤后轴突再生和神经功能改善。

籼稻粤泰B成熟胚愈伤组织诱导培养条件初探

对籼稻HL-CMS保持系粤泰B种子成熟胚的愈伤组织诱导培养条件进行了初步探讨。结果表明,将存储的成熟种子于50℃预处理2 d,种子表面清洗消毒后,晾干2～3 h,在1 800μmo1.m-2.s-1光照12 h/黑暗12 h、温度为24～30℃的较大的组织培养室内,采用pH5.9～6.0、添加3.0 mg.L-1 2,4-D的N6培养基上,粤泰B种子的愈伤诱导率可达93%,且愈伤组织的生长状况很好,为不育基因向籼稻HL-CMS保持系粤泰B的遗传转化奠定了基础。

大黄素甲醚联合脐带间充质干细胞移植对创伤性脑损伤大鼠MMP-9和TIMP-1蛋白酶的影响

目的观察大黄素甲醚联合人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)移植对颅脑损伤大鼠脑组织MMP-9和TIMP-1蛋白酶的影响。方法将40只2-3月龄,体重200～250g,清洁级Wistat大鼠随机分为正常对照组(10只)、TBI组(10只)、HUC-MSCs移植组(10只)、HUC-MSCs移植+大黄素甲醚组(10只)。ELISA法检测基质金属蛋白-9(mat rix metalloproteinase-9,MMP-9)和金属蛋白酶组织抑制物-1(tissue inhibi-tor of metall oproteinase-1,TIMP-1)的表达。结果与模型组比较,HUC-MSCs移植组、HUC-MSCs移植+大黄素甲醚组大鼠脑组织中MMP-9表达减弱,TIMP-1表达增强。结论大黄素甲醚可使脑损伤大鼠微血管基底通透性降低,减轻脑水肿程度,并与HUC-MSCs有协同作用,其作用机制可能与增加TIMP-1表达以调节MMP-9平衡有关。

胰岛素分泌细胞移植治疗Ⅰ型糖尿病的研究进展

Ⅰ型糖尿病(type Ⅰ diabetes mellitus,T1DM)是目前严重危害人类健康的常见病、多发病,全世界约有2%～5%的人患有此种疾病,且呈逐年增长趋势,多见于儿童和青少年.从降糖药物到胰岛素,从胰腺移植到胰岛移植,T1DM的治疗经历了一个漫长的过程.近年来研究发现,由胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)、胰腺干细胞及其它组织干细胞等诱导分化为胰岛素分泌细胞(insulin-serecting cells,ISC),可望解决移植过程中存在的供体不足的问题.着重介绍了几种ISC的来源和诱导分化途径,分析了各种途径的优势及不足.

核移植与线粒体

线粒体是哺乳动物的产能、供能细胞器,与生长、发育、衰老和凋亡等多种细胞事件及疾病有关。哺乳动物核移植可能导致克隆胚胎及后代中线粒体的杂合性,从而影响到个体的表型甚至导致线粒体疾病。文章阐明了哺乳动物中线粒体的生物学功能及遗传特性,并分析了核移植中供体细胞和受体卵胞质两种来源的线粒体在同种胚胎细胞核移植、同种及异种体细胞核移植重构胚发育进程中的变化以及可能影响线粒体杂合性的一些因素,对其可能导致的线粒体疾病及解决方法进行了简单的阐述。

雄性受体小鼠性腺对移植卵巢卵母细胞生长发育的影响

目的探索雄性受体性腺对移植卵巢卵母细胞生长发育的影响。方法将1日龄小鼠卵巢移植入成年雄鼠肾囊下,将雄性受体小鼠分为性腺摘除组和性腺在位组,于21d回收移植卵巢,以评价雄性小鼠性腺对新生小鼠卵巢移植体卵母细胞生长发育的影响。结果移植后21d,性腺摘除组和性腺在位组卵巢回收率分别为80.0%和92.9%,移植体生长增大;每个卵巢平均回收卵母细胞数分别为(30.4±4.3)和(42.4±11.1)个,两者差异不显著(P>0.05);性腺摘除组回收的均为GV期卵母细胞,性腺在位组大部分为GV期卵母细胞,有的达到MII期。结论雄性受体小鼠能够支持移植卵巢卵母细胞的生长发育,雄性受体的性腺对其影响不明显。