植物原生质体分离及其瞬时转化的应用

原生质体已被广泛应用于亚细胞定位、基因表达分析、蛋白-蛋白互作、基因编辑等方面。笔者总结了酶解法分离植物原生质体的影响因素,电穿孔和PEG介导的方法对原生质体瞬时转化效率的影响和瞬时转化的应用。植物的种类、不同的PEG浓度、转染时间、DNA浓度和原生质体数量都会影响PEG介导法对原生质体瞬时转化效率。电穿孔法必须在脉冲电压、脉冲长度、脉冲数、细胞数、DNA浓度都适宜的条件下才能达到最佳转化效率。本文为更多植物原生质体分离体系和瞬时转化体系的建立提供参考。

胸腺素α_1-硫氧还蛋白融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究

胸腺素α1(thymosinalpha 1,Tα1)作为一种免疫增强剂 ,临床用途广泛。为了大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子用人工方法合成Tα1基因 ,克隆于 pUC19的EcoRI和PstI位点 ,经测序证明序列正确后 ,串联为 4串体 (Tα1④ ) ,经再次测序确认后克隆入 pThioHisA的EcoRI和PstI位点 ,转化大肠杆菌TOP10菌种 ,酶切鉴定证明正确后 ,经 1mmol/LIPTG诱导 4h ,获得硫氧还蛋白与Tα1④的融合表达 ,并经Westernblot分析证实。用离子交换柱层析可纯化出硫氧还蛋白与Tα1④的融合蛋白 ,利用3H -TdR掺入法证实 ,该融合蛋白具有刺激小鼠脾淋巴细胞的活性。

DCN基因转染对大鼠肾系膜细胞生长及表型改变的影响

目的 通过观察转染DCN基因的大鼠系膜细胞 (MsC)生长及其一些表型的改变 ,为其用作细胞载体回输入大鼠肾病模型体内进行基因治疗奠定实验基础。方法 采用MTT比色法和流式细胞仪技术 ,检测该MsC株生长情况 ;Northernblot和Westernblot法检测其TGF β1mRNA、ColⅣmRNA和TGF β1蛋白表达水平 ;半定量RT PCR法检测其TIMP 2mRNA表达的改变。结果 与未转染MsC相比 ,转染DCN基因的MsC株的生长受到明显抑制 (5d时P <0 .0 5 ,6d时P <0 .0 1) ;G0 /G1期比例增加 ,S期比例降低 ,提示其生长缓慢 ;TGF β1和ColⅣmRNA表达明显降低 ,TGF β1蛋白分泌减少 ;TIMP 2mRNA表达明显下调。 结论 转染DCN基因的MsC可被用作载体开展对大鼠系膜增生性肾炎的实验治疗。

奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的体外培养与鉴定

为体外培养纯化出稳定的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞,试验通过外科手术的方法取妊娠后期或泌乳期的荷斯坦奶牛乳腺组织,分离乳腺腺泡,用组织块法体外培养奶牛乳腺细胞,应用差时胰酶消化法和差速贴壁法将奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞分别纯化出来,并用免疫组化的方法对细胞的纯度进行鉴定。结果表明:纯化的奶牛乳腺上皮细胞多为多角形,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多呈鹅卵石样或铺路石样生长,并可分泌乳滴,角蛋白-18反应阳性,波形蛋白反应阴性;纯化的奶牛乳腺成纤维细胞多为长梭形,呈旋涡状或放射状生长,角蛋白-18反应阴性,波形蛋白反应阳性;经纯化后2种细胞的纯度均可达95%以上,可满足后续试验的要求。

两种淡水贝类的核型分析

采用活体注射氯化钴和秋水仙素的方法,对中华圆田螺Cipangopaludina cathayensis和背瘤丽蚌Lam-protula leai的核型进行了分析。结果表明:中华圆田螺二倍体染色体的数目为18,核型为2n=8m+10sm,染色体臂数(NF)=36;背瘤丽蚌二倍体染色体数目为38,核型为2n=24m+12sm+2t,NF=74。两物种中均未发现随体和性染色体。

天花粉蛋白突变体的构建及其在原核系统中的表达

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体,并将其在原核系统内进行表达及纯化。方法:借助计算机预测TCS可能的抗原决定簇(YFF81-83)并设计出适当的突变引物。以栝楼基因组DNA为模板,利用重组PCR技术扩增TCS突变体全长基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将所获阳性重组质粒转化感受态E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行W estern b lot鉴定。最后用N i-NTA亲和层析柱对所获突变体蛋白进行纯化。结果:成功构建了TCS突变体(TCSYFF81-83ACS),并获得了突变体蛋白在大肠杆菌内的可溶性高效表达,经N i-NTA亲和层析柱纯化后,产生出大量均一的TCS突变体蛋白。结论:TCS的定点突变及其在原核系统内的表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。

基于线粒体ND4基因的鼢鼠系统进化关系

为探讨甘肃境内鼢鼠的系统进化关系，采用PCR技术对采集的4种鼢鼠线粒体DNA ND4序列进行扩增，经序列测定后用Clustal X1．83对比，获得了17条长度为425-438bp不等的同源序列。通过DAN SP4．0比较分析，共检出160个多态信息位点，定义了15种单倍型，单倍型多样度为（Hd）：0．980±0.024。采用MEGA4．0中的NJ法、MP法构建的分子进化树表明：高原鼢鼠两群体聚在一起后再与斯氏鼢鼠聚在一起，处于较进化的位置，后与秦岭鼢鼠聚在一起形成一进化枝，再与甘肃鼢鼠群体聚在一起，甘肃鼢鼠最先分化出来，且单独成一进化枝。

草原红牛胎儿成纤维细胞的分离培养及性别鉴定

为了获得高质量的草原红牛胎儿成纤维细胞,试验以发育40 d的草原红牛胎儿为材料,采用组织块贴壁法及胶原酶消化法分离纯化草原红牛胎儿成纤维细胞,并绘制生长曲线,再以SRY基因为模板设计性别鉴定引物,通过对已知性别草原红牛血液基因组PCR扩增检验所设计引物的性别特异性,最后采用基因组PCR方法鉴定分离得到的成纤维细胞的性别。结果表明:成功分离纯化出草原红牛胚胎成纤维细胞,经基因组PCR检验该细胞株性别为雄性。

自噬分子机制的研究进展

自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象,是生物在其发育、老化过程中都存在的一个净化自身多余或受损细胞器的共同机制。生命体借此维持蛋白代谢平衡及细胞环境稳定,这一过程在细胞清除废物、结构重建、生长发育中起重要作用。本文主要对自噬体的发生过程、分子机制和信号调控等方面进行概述,以期较为全面地了解细胞自噬作用和最新研究动态的相关资料。

菊粉酶基因重组酵母菌水解蔗糖的研究

表达蔗糖酶活性的菊粉酶基因工程菌株GS115/INU1,经甲醇诱导发酵72h蔗糖酶活力为119.8U/mL。该酶水解蔗糖最适温度为55℃、最适pH值为4.5。50%蔗糖溶液,加酶量12.0U/g底物、水解6h,蔗糖水解率达到89.5%。

甘肃4种鼢鼠线粒体DNA控制区序列分析及其系统进化关系

采用PCR技术对甘肃省境内4种鼢鼠线粒体DNA控制区序列进行扩增测序,获得了23条长度为414～424 bp的同源序列.通过序列比较分析,共检出179个多态信息位点,定义了15种单倍型,单倍型多样度（Hd）为：0.941±0.340.同源基因序列平均含AT碱基65.6%,GC碱基34.4%.基于控制区对其构建的分子进化树表明：4种鼢鼠构成2个进化枝,高原鼢鼠和斯氏鼢鼠先聚在一起,后与秦岭鼢鼠聚在一起构成一枝;甘肃鼢鼠构成另一枝,处于基部,其分别与采集的三个地理种群相对应.

水牛卵母细胞去核方法的摸索

本研究对水牛卵母细胞的去核方法进行了摸索。首先通过盲吸法去核,摸索水牛卵母细胞在体外成熟不同时间的成熟率和去核率;其次采用spindle-View系统去核,摸索用这种系统去核的最佳时间。水牛卵母细胞IVM16-18h与IVM 19-21h的成熟率之间有显著差别(43.0％vs58.2％,P<0.05),与22-24h组的成熟率之间有极显著差别(43.0％vs 68.8％,P<0.01).而去核率的情况刚好相反。随着卵母细胞成熟时间的延长,卵细胞的核与PB1的相对距离增大。在体外成熟18h,20h,22h,有较大比例(分别为72.6％、67.9％、64.0％)的卵母细胞中的核与PB1的位置较近,但当成熟时间增加到24h时,这一比例下降到57.6％(72.6％vs 57.6％,P<0.05),如采用Spindle-View系统去核则可消除成熟时间对去核率的影响,这些结果表明:1.水牛卵母细胞的成熟时间的延长不断提高,而去核率呈下降趋势;2.水牛卵母细胞成熟时间的延长会增加核与PB1的相对距离;利用Spindle-View系统可提高成熟时间较长的卵母细胞的去核率。

从Cyt b基因全序列探讨鼢鼠属Eospalax亚属的分子系统发育

测定了24只鼢鼠,其中包括:9只高原鼢鼠(Myospalax baileyi)、6只甘肃鼢鼠(M.cansus)、6只斯氏鼢鼠(M.smith)、3只秦岭鼢鼠(M.rufescens)的细胞色素b基因全序列,分析了鼢鼠属凸颅鼢鼠亚属的遗传多态性。从GenBank获得19条细胞色素b基因全序列,用最大简约化法绘制出43条序列的系统发育树,分析个体间的系统演化关系。研究认为,秦岭鼢鼠和斯氏鼢鼠遗传关系最近,并且与甘肃鼢鼠、高原鼢鼠关系接近;前4种鼢鼠与罗氏鼢鼠,中华鼢鼠和东北鼢鼠依次疏远;草原鼢鼠最早的分歧出来。

稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建

为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.

RNA干扰研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)启动的序列特异的转录后基因沉默现象,广泛存在于真菌、植物和动物中。它是细胞内由双链RNA诱导降解与其配对的特定mRNA的过程。细胞内双链RNA在酶的作用下,形成20-25碱基大小的小干扰RNA(siRNAs),由siRNAs进一步掺入多组分核酸酶并使其激活,从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA,抑制该基因在细胞内的翻译表达。RNAi技术是近年来迅速发展起来的高效、特异、易操作的基因沉默技术。与反义寡核苷酸等传统方法相比,RNAi技术有着无可比拟的优势。本文就其近年的研究进展作一综述。

细胞质雄性不育系统中的核质互作研究进展

细胞质雄性不育和育性恢复是一种普遍的生物学现象,它为研究植物的核质互作效应提供了理想的材料。本文对鉴定与细胞质雄性不育相关基因的方法以及目前细胞质雄性不育系统中的核质互作研究现状进行了综述。

4种鼢鼠线粒体DNA D-loop区全序列分析

采用PCR测序技术对采自甘肃境内的4种鼢鼠22个个体的线粒体DAN D-loop区全序列进行了测定。结果表明:鼢鼠线粒体DNA D-loop序列长度为893、894、895、896或899 bp,核苷酸位点突变类型有5种,即转换、颠换、插入、缺失及转换与颠换共存。碱基转换以T<=>C形式为主。其中T、C、A、G 4种核苷酸的平均比例分别为34.1%、24.3%、30.1%、11.5%,A+T含量(64.2%)明显高于G+C含量(35.8%)。这4种鼢鼠22条线粒体DNA D-loop区发现20种单倍型,单倍型比例为81.82%,说明中国鼢鼠mtDNA遗传多态性很丰富。从系统发育树分析,4种鼢鼠明显聚为两类,推测鼢鼠可能有两个起源。

拟南芥AtPSK3基因的克隆及序列分析(英文)

根据拟南芥基因组数据库提供的信息,首次以特异引物经PCR技术克隆到拟南芥硫肽激素α的一个前体基因———AtPSK3,并对其进行了测序。序列分析表明,所获得的AtPSK3基因全长为505bp,含有一个内含子和两个没有3′或5′非转译区的外显子,与数据库提供的序列比较,同源性为100%。

外周血细胞DNA、RNA及血红蛋白同时提取法

采用淋巴细胞分离液分离外周血中的有核细胞,经细胞裂解液处理,上清提取RNA,沉淀提取DNA,用分离液分离所得红细胞沉淀制备血红蛋白溶液。经对抽提物质量进行评价,发现3种提取物质量均高。本法能从少量外周血中同时分离DNA、RNA及血红蛋白,高效易操作,值得推广。

hβ-NGF基因真核表达载体构建及亚细胞定位

目的构建含EGFP标签的人β-神经生长因子(hβ-NGF)的真核表达载体,观察和分析其在HEK293细胞中的定位,为后续基因转移实验奠定基础。方法PCR扩增hβ-NGF基因编码框,连接到pEGFP-N1载体,将HEK293细胞分为对照组(不转染)、空载组(转染pEGFP-N1质粒)和实验组(转染pEGFP-N1-hβ-NGF质粒),后两组采用脂质体法转染,24h后荧光显微镜下观察EGFP瞬时表达及细胞定位,通过蛋白序列数据库和生物信息学软件进一步分析亚细胞定位。结果经双酶切和测序鉴定,pEGFP-N1-hβ-NGF真核表达载体构建成功。与空载组比较,实验组融合EGFP只少量分布于胞质中(P<0.05),不存在于细胞核内。生物信息学分析表明,hβ-NGF基因编码长241个氨基酸的肽链,由信号肽、前导肽和功能肽3段构成,含有2个N-糖基化位点,6个高度保守半胱氨酸残基,可以形成3个二硫键,是可溶、不稳定的分泌型蛋白;亚细胞定位该蛋白主要位于细胞外,部分分布于胞吞内体和高尔基体,以模序二聚体形式发挥生物学功能。结论成功构建了有活性的hβ-NGF真核表达载体,观察到融合蛋白在HEK293真核细胞系分泌表达,其亚细胞分布与生物信息学分析一致。