定点突变引入离子键提高植酸酶YiAPPA热稳定性的研究

本研究旨在通过定点突变引入离子键来提高植酸酶YiAPPA的热稳定性。对比YiAPPA与热稳定性优良的植酸酶r PhyXT52的分子结构,采用定点突变技术向YiAPPA中引入与rPhyXT52热稳定性相关的分子表面离子键,构建离子键突变体。通过热稳定性筛选,获得热稳定性显著提高的离子键突变体T209K/S220E/N237D。突变体T209K/S220E/N237D的酶学特性研究结果表明:突变体T209K/S220E/N237D于37℃、pH4.5的绝对酶活为3982.06 U/mg,与YiAPPA基本一致;T209K/S220E/N237D的最适反应温度、最适反应pH、pH稳定性以及蛋白酶抗性也与YiAPPA基本一致;与YiAPPA相比,T209K/S220E/N237D于80℃半衰期由14.81 min延长至24.72 min,半失活温度T_(50)^(30)由55.12℃提升至64.05℃,T_(m)值由48.36℃提升至55.04℃。分子动力学模拟显示,T209K/S220E/N237D中引入了新的离子键,提高了酶分子中构成这些离子键的氨基酸残基所在的结构单元的稳定性,从而提高了酶的热稳定性。本研究结果表明,向YiAPPA中引入离子键可有效提高其热稳定性,使其更适用于食品加工领域。本研究也可为植酸酶以及其他类型酶的热稳定性改造提供理论依据。

单酶法合成低分子量右旋糖酐的研究进展

低分子量右旋糖酐(Dextran)是以蔗糖为底物,由右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase, DSR)催化合成葡萄糖聚合物后,再经酸水解/酶水解形成的化合物,其分子量为10 000-20 000 Da,可广泛应用于医药、食品等行业。本文综述了单酶法合成右旋糖酐的研究进展,包括微生物法/酶法生产右旋糖酐的优缺点,DSR的高效表达,单酶法合成右旋糖酐的过程调控,DSR的固定化技术、结构和催化机理,以及单酶法合成低分子量右旋糖酐的研究现状,并在此基础上提出DSR单酶一步法直接合成低分子量右旋糖酐的思路。借助人工智能技术可获得更详细的DSR结构信息,在进一步解析DSR的结构、功能和催化机理的基础上,对其进行合理的设计和改进,优化酶学性质,实现单酶一步法直接合成低分子量右旋糖酐,可为生产低分子量右旋糖酐提供了新的理论支持。

湖羊瘤胃微生物来源的低温葡聚糖酶的表达与功能表征

葡聚糖酶作为添加剂在饲料、食品和纺织工业中具有重要的应用价值。本研究从湖羊瘤胃微生物c DNA中扩增IDSGH5-50基因,通过大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达,研究重组蛋白rIDSGH5-50的酶学性质和水解产物。结果表明:IDSGH5-50编码690个氨基酸,蛋白质分子量为75.78 kDa,等电点为4.75;重组蛋白rIDSGH5-50的最适反应条件为温度30℃、pH 6.0,且能在4~20℃下保持较高活性(>70%),在pH 5.0~8.0范围内稳定性较高。rIDSGH5-50的活性底物谱分析显示,rIDSGH5-50能催化大麦β-葡聚糖、地衣多糖、罗望子木葡聚糖和魔芋胶,对应的比活性分别为(10.42±0.16)、(7.12±0.08)、(7.03±0.38)、(5.94±0.65) U/mg。薄层色谱分析表明,在rIDSGH5-50催化下,大麦β-葡聚糖主要降解成纤维四糖和纤维五糖,地衣多糖主要降解成纤维三糖和纤维五糖,魔芋胶主要降解成纤维五糖,罗望子木葡聚糖主要降解成聚合度>5的寡糖。本研究报道了一种来自瘤胃球菌属的低温内切β-1,4-葡聚糖酶IDSGH5-50,为饲料、食品酶制剂开发奠定了基础。

采用复合生物酶处理的小麦秸秆生物机械制浆

制浆造纸行业面临着制浆过程污染控制难、制浆原料供应少、制浆工艺能耗高等问题。通过实验研究了三种生物酶复合后进行制浆,采用生物制浆与机械制浆相结合,同时设计了两次酶制剂处理,对农业废弃物小麦秸秆进行利用。可以很好地应对制浆原材料短缺,木材原料砍伐受限制的问题。在制浆过程中没有添加化学试剂,无制浆黑液的产生,避免了后期污水处理的困难及排放后对环境的污染。对制浆成纸后的纸张性能进行测试,发现相比于单纯的机械制浆和一次酶处理,二次生物酶处理对纸张成纸强度有较大改善。相较于未经过处理的秸秆其中抗张强度提高近一倍,撕裂强度提高了36.5%,保水值提高78.8%。

白色瘤胃球菌双功能糖苷水解酶IDSGH5-23的表达与性质分析

葡聚糖酶和木聚糖酶等糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)是能水解、消减饲料中非淀粉多糖类抗营养因子酶制剂的重要组分。本研究基于前期构建的湖羊瘤胃微生物宏转录组文库信息,从瘤胃微生物c DNA中克隆了一种兼具葡聚糖酶和木聚糖酶双功能酶的基因IDSGH5-23,将其在大肠埃希菌中进行异源表达,并研究了重组IDSGH5-23蛋白的催化性质。结果表明:IDSGH5-23的理论分子量和等电点分别为45.8 kDa和4.44,与来自白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)的GH5蛋白(GenBank登录号:WP_013499238.1)的氨基酸序列相似度达99.51%。在本试验条件下,IDSGH5-23的最适反应温度和pH值分别为30℃和6.0,在pH 4.0~7.0范围内较为稳定;IDSGH5-23能高效催化大麦β-葡聚糖、地衣多糖、魔芋胶和榉木木聚糖,其中,水解地衣多糖主要生成纤维三糖,水解大麦β-葡聚糖生成聚合度大于3的纤维寡糖,水解榉木木聚糖生成木三糖至木六糖。综上所述,本研究获取了一个来自瘤胃微生物的兼具葡聚糖酶和木聚糖酶双功能酶的IDSGH5-23,为研发饲用酶制剂和制备寡糖奠定了基础。

特异性乳糖酶的开发研究进展

乳糖酶是一种重要的生物催化剂,基于其水解和转糖苷功能,能水解乳糖和生产低聚半乳糖。在乳糖酶的实际应用中,受复杂反应体系和反应条件(不适宜的酸碱度、高温和有机溶剂)的影响,乳糖酶的稳定性和酶活性较差,制约了乳糖酶的应用。因此,开发适应工业应用条件的特异性乳糖酶及其高效生产的研究一直是研究者们关注的焦点。本文在介绍耐热乳糖酶、低温乳糖酶、耐盐乳糖酶、酸性乳糖酶和耐溶剂化乳糖酶的研究的基础上,综述特异性乳糖酶的催化机制、高产菌株培育、定向进化以及应用策略等方面的进展,并对工业应用前景进行展望,以期为特异性乳糖酶的深入探索和应用开发提供参考。

腈水解酶立体选择性改造及其合成布瓦西坦

布瓦西坦是新一代抗癫痫药物,具有广阔的市场前景。利用腈水解酶立体选择性催化3-氰基己腈合成关键手性中间体(R)-3-氰基己酸,进一步经加氢、环化、手性拆分等合成布瓦西坦路线,具有原子经济性高等优势,然而目前挖掘的腈水解酶存在立体选择性差等缺陷。以腈水解酶PgNIT为研究对象,通过对其催化口袋和亚基界面改造获得了立体选择性大幅提高的突变体F164W/I202R,产物光学纯度由野生型的86%提升至97%,E值由17提高至111。分子动力学模拟研究表明,F164位点的改造减小了(R)-3-氰基己腈深入催化口袋内部的空间位阻,而“A”界面I202位点的改造增加了亚基之间缔合的距离和催化口袋区域的原子动态协同性,从而显著提升了腈水解酶的立体选择性。

枯草芽孢杆菌产凝乳酶发酵条件的优化

为进一步提高枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)液态发酵产凝乳酶(milking-clotting enzyme,MCE)的能力,采用单因素试验和响应曲面法对枯草芽孢杆菌液态发酵的产酶条件进行研究和优化。结果表明:最优发酵工艺为:葡萄糖添加量16.2g/L,在500mL三角瓶中装53.3mL料液,接种量为体积分数0.130%,发酵时间120.43h,预测酶活力为1097.30SU/mL,经实验验证,在该条件下发酵产凝乳酶的酶活力为(1129.05±74.55)SU/mL,与模型预测值相符。

利用响应面法优化茶薪菇产纤维素酶的发酵条件

用响应面法对茶薪菇产纤维素酶的发酵条件进行了优化。首先用Plackett-Burman法筛选出三个影响较大的重要因素,分别为:碳源、初始pH值和发酵时间,然后进行最陡爬坡实验逼近最佳响应面区域,最后通过Box-Behnken设计,利用SAS软件进行回归分析,得到各因素的最佳水平。在优化的培养条件下,纤维素酶的产量提高约45.26%。

微生物碱性蛋白酶的研究与开发

微生物碱性蛋白酶被广泛应用于洗涤、食品、皮革及纺织等制造工业中.本文围绕碱性蛋白酶的研究与开发,对微生物碱性蛋白酶的来源、表达调控、分子改造、构效关系及应用进行了阐述,指出了今后的研究方向.

DXA测量活体大鼠骨的精密性及骨丢失的检测

目的 了解QDR - 45 0 0A型双能X射线吸收法 (DXA)测量活体大鼠的精密性和探测去卵巢后大鼠骨丢失的能力。方法 测量 15只体重为 2 0 2～ 311g的SD大鼠全身、股骨及腰椎的骨密度 (BMD) ,每只大鼠测量 3次 ,可得变异系数 (CV) ,15只大鼠CV的平均值为该指标的批内CV。结果 ①全身、股骨、腰椎BMD的批内CV分别为 0 71%、2 0 2 %和 2 44 % ,全身BMD的批内CV显著低于股骨和腰椎 (P <0 0 5 ) ;②全身BMD的批间CV为 0 99% ,股骨整体为 2 81% ,腰椎总体 (L3～L6 )为 3 42 % ;③术后 4周去卵巢组全身、股骨、腰椎BMD与假手术组比较无显著性变化 ,而股骨远侧干骺端BMD低于假手术组 (P <0 0 5 ) ;④去卵巢后 14周腰椎总体 (L4～L6 )的BMD低于假手术组(P <0 0 5 )。结论 QDR - 45 0 0A型DXA测量大鼠全身、股骨和腰椎BMD有较好的精密性 ,全身优于局部骨骼 ;

壳聚糖酶的基因克隆表达及酶学性质研究

作者从NCBI数据库中挖掘到来源于Butyrivibrio sp.MC2013的壳聚糖酶基因,命名为BUT,该壳聚糖酶基因大小为903 bp,编码301个氨基酸。通过NCBI数据库和进化树比对发现,该壳聚糖酶(BUT)属糖苷水解酶46家族(后简称GH-46),与其它壳聚糖酶相似度为59%,是一种新型的壳聚糖酶。序列经密码子优化后进行全基因序列合成,与表达载体pET21a(+)连接构建重组质粒p ET-21a-BUT,转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达宿主,进行诱导表达。所得重组壳聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,SDS-PAGE确定其蛋白分子量为35 kDa,DNS法测定其酶活为146.0 U/mg。对BUT酶的酶学性质进行探究,结果表明BUT酶最适温度和pH分别为45℃、8.0,在中性偏碱性条件下稳定性较强。Mn^(2+)对其酶活力具有促进作用,SDS、Fe^(3+)、Cu^(2+)、Zn^(2+)等的抑制作用极强。通过TLC对其水解产物分析发现,BUT水解壳聚糖的产物是壳二糖、壳三糖和壳四糖。

酶处理对混合杨木P-RC APMP浆打浆性能的影响

探讨了纤维素酶、木聚糖酶处理对混合杨木温和预处理和盘磨化学处理的碱性过氧化氢机械浆(P-RC APMP)的打浆性能和打浆能耗的影响。结果表明:与未经过酶处理浆相比,纤维素酶和木聚糖酶处理可明显改善纸浆的打浆性能和降低打浆能耗,纸浆打浆度提高1.0～6.5°SR,或在相同打浆度下打浆能耗降低10%～25%。纤维素酶处理浆裂断长提高18%,撕裂指数提高14%,耐破指数提高16%,耐折度提高100%。木聚糖酶处理纸浆白度提高1.7度(ISO),纸浆物理强度略有上升。纤维素酶在改善纸浆打浆性能、降低打浆能耗和提高物理强度方面好于木聚糖酶,木聚糖酶在改善纸浆光学性能方面优于纤维素酶。酶处理可以使纸浆纤维结构变得疏松柔软,从而增强纤维间的交织能力。

复合酶制剂对热应激下奶牛生产性能的影响研究

试验选用48头产奶量、胎次、泌乳时间和体况评分相近的健康荷斯坦奶牛,随机分为4组,每组12头。分别为对照组(不添加复合酶制剂)、试验A组(添加复合酶制剂10 g/d)、试验B组(添加复合酶制剂20 g/d)和试验C组(添加复合酶制剂30 g/d)。基础日粮为粗料加精料补充料,试验期共55 d,预饲期15 d,正式期40 d。结果表明:在试验第一阶段,各试验组奶牛产奶量与对照组相比有所提高,但差异不显著(P>0.05);在第二阶段,各试验组奶牛产奶量比对照组分别提高了6.46%、8.82%和7.43%,差异均显著(P<0.05);在整个试验期,各试验组奶牛的乳成分与对照组相比无显著差异(P>0.05)。

功能性低聚糖合成中糖基转移酶研究进展

低聚异麦芽糖、低聚果糖、岩藻糖基化寡糖和唾液酸化寡糖等功能性低聚糖因具有显著促双歧杆菌增殖的作用,已被广泛应用于婴幼儿乳粉及食品中,目前合成这些功能糖的主要途径是利用微生物所产的α-葡萄糖基转移酶、果糖基转移酶、岩藻糖基转移酶或唾液酸转移酶等糖基转移酶,以葡萄糖、蔗糖或乳糖等作为底物进行合成。本文针对这几类微生物糖基转移酶的来源、性质、活性、表达和在功能性低聚糖合成中的应用以及相关研究进行简要的概括和总结,为高活力糖基转移酶的研究与开发以及改善其在功能低聚糖生产中的应用性能提供一定的参考。

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。重组毕赤酵母遗传稳定性良好。

桔青霉发酵制备核酸酶P1研究进展

核酸酶P1是一种重要的工业酶制剂,可用于水解核酸生产5’-核苷酸。本文综述了利用桔青霉发酵得到核酸酶P1的菌种选育、培养基优化、发酵工艺控制、浓缩、相关应用和国内外市场状况。

枯草芽孢杆菌工程菌产耐酸性高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用基因工程手段获得的产耐酸性高温α-淀粉酶基因枯草芽孢杆菌工程菌株pWB-amyd/WB600,通过单因素筛选及正交实验进行发酵培养基优化,得到的最佳配方为(g/L):玉米粉20,蛋白胨30,CaCl20.5,Na2HPO48.同时对实验室摇瓶条件下液体发酵的主要影响因素初始pH、接种量、装液量、转速、温度等进行探讨,确定了最佳培养条件:37,℃、pH 6.5、200,r/min摇床培养36,h,接种量为2%,装液量为30,mL/250,mL.在此优化条件下,耐酸性高温α-淀粉酶活力达到3,980,U/mL,是未优化条件下的2.1倍.

黄粉虫中提取纯化超氧化歧化酶的工艺研究

本研究以黄粉虫粉为原料,经盐析沉淀,DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析和Sephadex G200凝胶过滤层析等纯化步骤,获得了其中的一种超氧化物歧化酶(SOD)。酶的纯化倍数为78.3倍。SDS-PAGE电泳显示为均一的蛋白谱带。经鉴定该酶为Cu.Zn-SOD。本研究为从黄粉虫中提取SOD提供了一种较好的工艺。

绿色饲料添加剂——果胶酶的研究

果胶酶是降解饲料抗营养因子——果胶的有效酶,它作为一种绿色饲料添加剂在畜牧业生产中的应用越来越广泛。文章针对这一现状,主要对果胶酶的性质、分类、作用机理作一阐述,并对其研究前景进行简要概括。