大口黑鲈源维氏气单胞菌致病菌的分离鉴定及其毒力和耐药基因分析

【目的】分离大口黑鲈(Micropterus salmoides)患病组织中的致病菌,鉴定致病菌的生理特性,分析其毒力和耐药基因,以期指导临床科学用药。【方法】从广东湛江某养殖鱼厂的患病大口黑鲈病变组织中采集样本,采用稀释涂布法分离细菌,经16S rRNA基因序列比对和生化试验鉴定种属,并进行毒力基因、耐药基因和药敏特性等鉴定。【结果】分离出菌落形态呈圆形、表面光滑呈乳白色、不透明的细菌,编号为MSB-2。经革兰氏染色、生理生化反应等表型鉴定为革兰氏阴性菌中的气单胞菌属(Aeromonas)。通过扩增16S rRNA基因序列并构建系统发育树,进一步鉴定该菌为维氏气单胞菌(A.veronii)。该菌株具有act、aer、aexT等毒力相关基因及tetC、tetA、sull等耐药相关基因。药敏试验结果表明,该菌对羧苄西林、多西环素、头孢氨苄、新霉素、庆大霉素、头孢拉定、米诺环素、头孢唑林等药物敏感。对健康大口黑鲈进行人工回归感染病原菌后,出现与病鱼相似的临床症状,如腹鳍及胸鳍基部充血、肛门红肿、腹部明显膨大等,解剖发现腹腔有大量积液,与自然患病的症状相同。【结论】维氏气单胞菌是引起此次大口黑鲈疾病的致病菌,养殖过程中可选用新霉素、多西环素等批准渔用药物进行防治。

植物病害生防青霉研究现状

青霉抗菌谱广、抗逆性强,是优良的生防微生物,能有效防治植物病害.论文综述了近年来青霉属生防真菌防治植物真菌、卵菌、线虫和细菌病害的研究成果,生防青霉产生的抑菌活性次生代谢产物种类以及基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白质组学和培养组学在生防青霉研究中的应用,并对今后生防青霉的研究进行展望,以期为以后研究及应用提供借鉴.

内化菌耐受性Tr值评估方法研究

【目的】建立一种全面考虑宿主细胞、内化菌、抗菌药物三者互作的评估方法来精准比较内化菌介导的抗菌药物耐受情况。【方法】以IEC-6、RIMVECs和RAW264.7细胞为宿主细胞,以金黄色葡萄球菌和沙门菌作为内化菌,以氨苄西林、环丙沙星、四环素等7种化学药品及槲皮素和山柰酚等4种中药标准品为抗菌药物,检测抗菌药物细胞外最小杀菌浓度(MBC EX),建立细菌-细胞感染互作模型,利用细菌菌落计数检测抗菌药物细胞内最小杀菌浓度(MBC IN)。测定内化菌感染细胞的百分比(N)及药物治疗后内化菌感染细胞的百分比(N D)。通过计算得到内化菌耐受值(Tr),对内化菌的抗菌药物耐受性进行评估。【结果】金黄色葡萄球菌对氨苄西林、环丙沙星、红霉素、多黏菌素、利福平、四环素、万古霉素7种化学药品和中药标准品黄芩苷均产生了耐受性(Tr值>1),其中,对环丙沙星耐受性Tr值最高,耐受程度最严重;对槲皮素、山奈酚和儿茶素不产生耐受性(Tr值≤1)。不同内化菌对四环素的耐受性结果显示,金黄色葡萄球菌对四环素产生的耐受性Tr值大于沙门菌。不同宿主细胞对内化菌介导的抗菌药物耐受性的影响显示,IEC-6细胞中金黄色葡萄球菌对四环素的耐受性最高。【结论】耐受性Tr值评估方法不仅可有效评估内化菌对不同抗菌药物的耐受程度,还可比较不同宿主细胞对内化菌介导的抗菌药物耐受性的影响,将内化菌对抗菌药物产生的耐受性可视化和数据化地呈现出来,为临床精准用药提供指导。

矿泉水中粪链球菌的检测能力验证结果与分析

为提高实验室对矿泉水中粪链球菌的检测能力,确保其检测数据的准确性和可靠性,先采用国标方法计数,后采用传统微生物鉴定法、全自动微生物鉴定法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(简称MALDI-TOF MS)3种方法对可疑菌进行鉴定。结果表明,3种方法均成功鉴定出粪链球菌,且样品23-A864和23-N843的Z值分别为-0.5和-0.1,满足要求。3种方法相互验证,其中基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法具有耗时短、效率高的优势。

湛江地区患病对虾池塘中副溶血性弧菌的MLST分型和新型耐药毒株的分离鉴定

为研究湛江地区患病对虾养殖池塘中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的遗传多样性,选择副溶血性弧菌的7个管家基因对分离菌株进行MLST分型,采用PCR法检测tdh、trh、tlh、mam7、vcrD1、vcrD2和pirAB毒力基因的携带情况,用纸片扩散法对所有菌株进行药敏试验,选择其中1株多重耐药菌株进行全基因组测序,并通过IslandPath-DIOMB分析其耐药基因岛来源。结果表明:从患病的对虾池塘水样中共分离出58株副溶血性弧菌,通过MLST分型共分为34个ST型;58株菌株均携带毒力基因tlh、mam7和vcrD1,未发现tdh、trh和vcrD2基因存在,其中,8株菌株携带引起急性肝胰腺坏死病(AHPND)的毒力基因pirAB;药敏试验显示,58株菌株对青霉素耐药率均为100%,对氨苄西林、克拉霉素和庆大霉素的耐药率较高,其中ST1740型的4株菌株均为多重耐药,从中选择ZJ20-3/2020菌株进行全基因组测序,发现该菌株含有8个耐药基因,分别为blaCARB-41、aadA16、aph(6)-Id、aph(3″)-Ib、tet(A)、sul1、dfrA27和ARR-3,并对青霉素、卡那霉素、四环素和利福平耐药;用IslandPath-DIOMB分析发现,ZJ20-3/2020菌株存在4个基因岛。研究表明,湛江地区患病对虾养殖池塘中的副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,发现了一个携带pirAB的新ST型(ST1740)菌株,其携带4种来自希瓦氏菌的基因岛且为多重耐药菌株,本研究首次在副溶血性弧菌中发现来自希瓦氏菌属的基因水平转移,这些结果为防治急性肝胰腺坏死病提供了科学依据。

产细菌素屎肠球菌的筛选鉴定及其抑菌特性

从采自四川红原的传统发酵酸乳中分离得到308株疑似乳酸菌,通过96孔板法初筛和平板打孔法复筛,筛选出1株具有明显抑菌作用的菌株SC-Y112。通过形态学观察、16S rDNA序列同源性分析和ropA管家基因序列同源性分析结合生理生化实验,鉴定该菌株为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。通过排酸及排除H2O2影响后,该菌株的发酵上清液仍具有明显抑菌活性,经蛋白酶处理后,抑菌效果明显消失或下降,说明发酵上清液中的抑菌成分具有蛋白质性质。进一步探究该菌株所产细菌素的生物学特性、遗传稳定性及抑菌特性表明,该细菌素在菌株接种后6 h产生,12 h达到最高;菌株在连续传代86代内,产细菌素能力较为稳定;细菌素在pH 3.0~7.0的条件下稳定,在100℃处理30 min后仍具有抑菌活性;SC-Y112所产细菌素具有广谱抗菌性,对单核细胞性李斯特菌有明显的抑菌活性。

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis LSZ9408菌株发酵特性的研究

本文研究了苏云金芽孢杆菌 LSZ94 0 8菌株的发酵特性 ,2 4 h菌体浓度达最大 ,2 8- 40 h菌体浓度稳定 ,4 0 h后菌体浓度下降 ,发酵液 p H值先降后升 ,最高达 p H7.8,2 0 h达到碳氮源利用高峰 ,2 8h后氮含量回升 ,糖含量基本不变。

基于OBE理念的高校“微生物学实验”课教学设计与实践

基于OBE教育理念对高校“微生物学实验”课程进行教学设计,通过线上线下混合式教学模式的实践和多元化的评价体系,提高学生的综合能力和课程教学质量,解决教学过程中遇到的实际问题,提高学生的实验技能、专业素养和创新能力,达成学生培养和教学改革的双重目标。实践证明,该教学模式有助于促进高校基础教育改革,对高校生物学实验类课程有借鉴意义。

一株沼泽红假单胞菌的分离与鉴定

目的分离与鉴定一株具有较高降解黄泔水能力的光合细菌。方法通过富集培养水塘污泥筛选光合细菌,经电镜观察其形态学特征、活细胞扫描以及碳源利用试验了解其生理生化特征,并通过16SrRNA的同源性比较,了解其序列保守性。结果从污泥中分离获得的一株光合细菌NS-04,革兰反应阴性,单个细胞为杆状至卵形,菌体大小为0.6～0.9μm×1.2～2.0μm,二分分裂,极生或亚极生鞭毛,片层状光合内膜,位于细胞质膜之下并与之平行,菌落为棕红色,光照厌氧和黑暗好氧条件下均可生长,菌体富含类胡萝卜素和细菌叶绿素a,能利用多种碳源,酵母膏对其生长有明显刺激作用,16SrRNA基因的分子系统学分析表明,该菌株与GenBank中的沼泽红假单胞菌标准菌株的同源性为97%。结论初步确定筛选出的菌种为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。

基于MiSeq测序技术石花酒大曲中微生物多样性解析

该研究采用Illumina Mi Seq高通量测序技术对襄阳市石花酒大曲中微生物多样性进行分析。结果表明,4个样品中优势细菌门(>0.1%)为变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria),且均为核心菌门;优势细菌属(>1%)为假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、魏斯氏菌属(Weissella)、明串珠菌属(Leuconostoc)和Kroppenstedtia。优势真菌门(>0.1%)为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和Mucoromycota,其中子囊菌门为核心菌门;优势真菌属(>1%)为复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、红曲菌属(Monascus)、热子囊菌属(Thermoascus)、青霉菌属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和Leiothecium。样品中假单胞菌属和曲霉属呈现显著正相关(P<0.05)。综上,4个石花酒大曲样品中共有大量的核心菌群,且样品中细菌与真菌有一定的相关性。

产气荚膜梭菌实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法的建立和比较

根据产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)高度保守的plc基因,设计特异性引物和探针,建立产气荚膜梭菌的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光聚合酶重组酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法。特异性分析结果表明,建立的两种检测方法特异性强,仅对产气荚膜梭菌有特异性扩增,对其他细菌均无扩增;两种方法的检出限均为1.3 pg/μL。在人工污染模拟样品的检测中,两种方法的检出限均为1.0×102 CFU/mL;实时荧光RPA需要3~13 min即可实现对所有阳性样品的检测,而实时荧光PCR则需要24~46 min(Ct值为17.45~33.65)。实时荧光RPA方法在检测时间、操作方便性和仪器便携性方面,明显优于实时荧光PCR方法。本研究建立的实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法特异性强、灵敏性高、操作方便,为实验设备装备较差的基层检测实验室和疫情突发现场产气荚膜梭菌的快速检测提供有效技术手段。

植物乳杆菌WW对高脂血症大鼠体脂的影响

为了研究植物乳杆菌WW(Lactobacillus plantarum WW)对高脂血症大鼠体脂的影响,将32只5周龄雄性SD大鼠随机分为4组:正常对照组(A)喂食基础饲料+无菌水、高脂模型组(B)饲喂高脂饲料+无菌水、脱脂乳对照组(C)饲喂高脂饲料+无菌脱脂乳、菌液干预组(D)饲喂高脂饲料+菌悬液(1×10^(10) CFU/mL),灌胃量为10 mL/kg m_b,12周后测定相关指标。结果显示:4组大鼠肾脏、脾脏和心脏指数差异不显著(P>0.05),而B组和C组肝脏指数显著高于A组和D组(P<0.05),说明L. plantarum WW无毒副作用,并且能够减少脂肪在肝脏的堆积;B组血清和肝脏血脂水平显著高于A组(P<0.05),说明造模成功;与B组相比,D组血清和肝脏各指标水平显著降低(P<0.05),粪便中总胆固醇、甘油三酯和总胆汁酸含量显著升高(P<0.05),说明L. plantarum WW能够促进胆固醇的排泄,进而降低大鼠体内胆固醇。这些结果表明植物乳杆菌WW可能是缓解高脂血症并用于功能性食品的潜在益生菌。

一种改进的纤维素分解菌鉴别培养基

以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源,培养纤维素酶产生菌株,培养一定时间后,经刚果红染色和稀碱液固定,在菌落周围形成透明水解圈,根据透明圈的大小,快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。与传统纤维素酶活检测方法比较,本方法菌丝生长快,两天后菌落经染色,透明圈边缘清晰,直观性强,与酶活力成一定的线性关系。

晚清书画裱件一株霉菌的鉴定及培养条件优化

对晚清书画裱件菌斑菌株复苏分离鉴定及培养条件优化.以改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基、萨氏培养基和查氏培养基作为复苏培养基.采用三点植入法和插片法对菌株形态学观察,通过PCR扩增、测序、构建系统发育树对菌株进行分子生物学鉴定.结果成功复苏一株霉菌,菌株鉴定为篮状菌属,最佳培养条件为改良后PDA培养基,培养温度30℃,pH 6.0,震荡频率130 r/min.

嗜冷微生物和冷育微生物的研究——Ⅳ.冰箱中产生怪味的冷育微生物

由冰箱中存放的豆制品、猪肉、蔬菜等食品中分离到34株产生不良气味的细菌。它们都是革兰氏阴性细菌,经鉴定分别属于假单胞菌属、气杆菌属、产碱菌属、欧文氏菌属和沙门氏菌属。它们都可以在5℃以下生长,最高生长温度均高于30℃,故都是冷育细菌。经气相色谱分析,形成不良气味的原因是在细菌生长过程中,产生了硫化氢、氨和一些挥发性有机酸等代谢产物,不良气味即这些混合气林所致。

基于高通量测序技术分析牛栏山大曲微生物多样性

为了探究牛栏山大曲的微生物菌群结构,为制曲工艺及成品曲质量评估提供理论依据,该研究采用高通量测序方法对牛栏山低温大曲原核16S rDNA V3/V4区和真核ITS1区进行微生物多样性分析。研究结果表明,从牛栏山大曲中共获得358种原核操作分类单元(OTU),乳酸菌类群是大曲中主体原核生物,维斯氏菌(Weissella confuse)、耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)分别占大曲总OTU的22.68%、16.54%和9.84%,同时大曲中高温放线菌(Kroppenstedtia eburnea)可占14.78%;而真核多样性较低,仅获得69种OTU,扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和库氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)是主体真核微生物,其余真核微生物含量较低;综上得出,牛栏山大曲中原核微生物多样性要远高于真核微生物,且大曲主体微生物较为明显。

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐·氟铃脲乳油制剂中甲氨基阿维菌素苯甲酸盐B_1a的高效液相色谱分析

以甲醇为溶剂 ,甲醇 + 0 .2 %三乙胺 +乙腈 (15 0 + 5 0 + 32 0 ,v/v)为流动相 ,采用 C18反相不锈钢色谱柱和波长 346 nm的紫外检测器对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐·氟铃脲乳油中的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐 B1a进行高效液相色谱定量分析。结果表明 ,甲氨基阿维菌素苯甲酸盐 B1a用该方法分析的标准差 0 .0 114 ,变异系数为 4 .4 5 % ,线性相关系数为 0 .9987,其平均回收率为 99.5 %。

乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法

目的:为快速准确检测乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌,建立实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)检测方法。方法:根据嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR保守区域设计特异性引物与探针,借助建立的实时荧光定量PCR方法进行特异性、灵敏度、重复性以及抗干扰能力验证,并利用模拟样品对方法进行检验,最后对市售的实际样品进行检测。结果:该方法的特异性较好;方法的绝对灵敏度达到3 pg,相对灵敏度达103 CFU/mL;重复性检测表明相对标准偏差在2.6%以下。同时进行杂菌干扰实验,在纯基因组水平和培养物水平混合大肠杆菌,扩增均无明显影响,表明建立的方法抗干扰能力较好。利用建立的实时荧光定量PCR方法对模拟样品进行检测并建立标准曲线,得出R^2为0.987,线性较好,可进行实际样品的检测。对市售的11份样品进行检测,其中6份含有嗜酸乳杆菌菌株,5份不含嗜酸乳杆菌菌株,标记嗜酸乳杆菌的样品全部检测出嗜酸乳杆菌且含量在5.83×10~2～3.68×1~04 CFU/mL之间。结论:建立的实时荧光定量PCR方法可快速、准确地检测出乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌。

rpoS对鳗弧菌MHK3株Hcp表达和杀菌能力的影响

溶血素共调节蛋白(Hcp)的合成和分泌是六型分泌系统(T6SS)行使功能的重要特征。RNA聚合酶的σ亚基RpoS参与调节细菌的生长和应激反应。为了探究RpoS对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)T6SS的调控作用,本研究构建了 MHK3ΔrpoS突变株,检测了部分表型特征的变化;利用lacZ半乳糖苷酶报告基因检测了突变株hcpl和hcp2在转录水平的变化;进行Western blot并定量分析突变株Hcp在翻译水平的变化;并通过细菌拮抗实验检测了突变株杀菌能力的变化。结果显示,MHK3ΔrpoS突变株的生长情况、泳动性、明胶酶活性及酪蛋白酶活性与MHK3野生株相比无显著差异(P>0.05),而平台早期的菌膜形成能力有显著上升(P<0.05);在各生长时期,MHK3ΔrpoS的hcpl和hcp2在转录水平的表达量均较MHK3有显著上升(P<0.01),最高时分别为MHK3的1.79倍和1.94倍;在翻译水平上,MHK3ΔrpoS在胞内和胞外Hcp的分泌均有显著升高(P<0.05),最高时分别为MHK3的1.59倍和1.31倍;同时,MHK3ΔrpoS对大肠杆菌(Escherichia coli) E5的杀菌能力约为MHK3的1%。研究表明,rpoS对鳗弧菌MHK3株的生长情况、泳动性、明胶酶活性及酪蛋白酶活性均无显著调控作用,但对平台早期的菌膜形成能力具有一定的负调控作用,在转录和翻译水平上也负调控Hcp的表达。而在杀菌能力上,rpoS发挥一定的正调控作用。说明菌株的杀菌能力强弱并非直接与Hcp的表达和分泌量正相关。本研究为进一步阐明T6SS的调控机制及其介导的杀菌作用机制提供了新思路,并丰富了其理论基础。

真丝文物霉变菌株的分离、鉴定及防霉药剂筛选

中国的桑蚕丝织业延绵千年,真丝文物记载了中国作为丝绸古国的辉煌历史,对中国古文化及古工业的研究都具有重要意义。而真丝文物在出土及保藏过程中极易遭受霉菌污染,严重影响文物的研究展示和文化价值的传承,成为各大博物馆和研究所的困扰。通过对真丝文物霉变菌株的分离及鉴定,可以了解真丝文物霉菌污染现状,为真丝文物的防霉控制提供靶标菌株。筛选真丝文物防霉处理剂可为探索真丝文物防霉控制方法提供新的思路,促进真丝文物防霉新技术的开发。本研究从苏州丝绸博物馆霉变真丝文物中分离纯化得到4株霉菌,分别编号为A、D、H、K。采用点植法培养真丝霉变菌株单菌落,观察其菌落特征和培养特性,通过显微观察法记录分生孢子形态、大小等显微结构,结合分子生物学方法构建系统发育树,对真丝文物霉变菌株进行鉴定。同时采用牛津杯法测试3-碘-2丙炔基-N-正丁基氨基甲酸酯(IPBC)、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)、苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)、聚六亚甲基单胍磷酸盐(PHMG)4种防霉剂对4株真丝霉变菌株的抑菌活性。结果表明:4株霉菌分别属于半知菌类丛梗孢目的3个属:曲霉属(Aspergillus),节孢霉属(Arthrinium)及芽枝霉属(Cladosporium),其中A属于节孢霉属,D属于曲霉属,H、K属于芽枝霉属。防霉剂毒力测试结果表明,不同菌株对不同防霉剂的敏感性不同。MIT及IPBC对真丝文物霉变菌株有良好的抑制效果,其中MIT对4株霉菌的抑菌活性最为明显,对A、H及K菌株的毒力均优于其他3种防霉剂,对D菌株的毒力仅次于IPBC,EC_(50)分别为56.2355 mg/L、292.1737 mg/L、190.0456 mg/L及62.6815 mg/L;IPBC的综合毒力仅次于MIT,对菌株D的毒力最高,EC_(50)分别为250.2830 mg/L、27.4540 mg/L、480.3257 mg/L及997.2392 mg/L。PHMG及BIT对4株真丝霉变菌株的抑菌活性相对较低。本研究通过对真丝文物霉变菌株的鉴定及防霉药剂的筛选,明确了4种真丝文物霉变菌株的生物学归属,确定了2种高效防霉处理剂,为真丝文物防霉手段的开发提出了新的可能,对进一步探究如何抑制真丝文物表面的霉菌生长,降低霉菌污染的危害,延长真丝展品及文物的保存提供了有效依据。