固氮菌Azotobacter salinestris代谢物脂肪酸分析及其抗氧化活性研究

[目的]探究固氮菌Azotobacter salinestris(As101)代谢物脂肪酸组成及抗氧化活性。[方法]采用气质联用法(GC/MS)进行脂肪酸组成分析;根据2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和羟基自由基清除能力测定抗氧化活性。[结果]固氮菌As101代谢物脂溶性成分中棕榈酸甲酯(11.34%)、邻苯二甲酸二丁酯(7.41%)、顺9,10-甲基十九烷酸甲酯(18.71%)、硬脂酸甲酯(3.08%)、12-甲基十四烷酸甲酯(8.02%)为主要成分,其次为油酸甲酯(5.01%)、(Z)-十六烯酸甲酯(3.44%)、14-甲基十六烷酸甲酯(1.67%)等。其中,不饱和脂肪酸达43.78%;固氮菌As101代谢物脂肪酸对DPPH自由基、ABTS自由基及羟基自由基的清除能力分别为53.05%、27.83%、43.77%。[结论]As101代谢物脂肪酸种类丰富,具有良好的开发利用价值及广阔的应用前景。

玉米根际联合固氮菌57-7菌株基本特性的研究

从四川省灌县地区的玉米根际分离到一株发酵型细菌，编号５７－７。经鉴定为日勾维肠杆菌，其最适生长温度为３０℃，最适生长ｐＨ为８．０。用＾１５Ｎ及乙炔还原测定，证实有固氮酶活性。乙炔还原活性最高达８３５４ｎｍｌＣ２Ｈ４·ｍｇ蛋白＾－１·ｈ＾－１。研究了Ｏ２、ＮＨ＾＋４、ＮａＣｌ对固氮酶合成、固氮酶活性及菌株生长的影响。

尾矿区不同植被恢复模式下高效固氮菌的筛选及Biolog鉴定

为了从铁尾矿中获得高效土著固氮菌,采用选择性无氮培养基从不同恢复模式下铁尾矿土样中筛选高效固氮菌,并且通过乙炔还原法对分离出的48株固氮菌进行固氮酶活性测定。结果表明:筛选出两株具有较高固氮活性菌株Db1与Ec1,Biolog鉴定为固氮菌属(Azotobacter),固氮比活力分别为203.20 nmol·mg-1·h-1和307.23 nmol·mg-1·h-1。不同植被恢复模式、物种多样性、尾矿坡向、工程措施、恢复年限均对尾矿固氮菌株数量有影响。样地处于尾矿阳坡,或属于人造混交林,或植被恢复年限长,又或者实施六孔砖、坡岩造地等工程措施的尾矿植被恢复模式下筛得的固氮菌菌株数较多或固氮活力较高。

糖蜜草内生固氮菌IS-PCR和16S rRNA基因全序列分析

采用插入序列指纹图谱分析(IS-PCR)和16S rRNA基因全序列分析,对来源于优良牧草———糖蜜草M elinism inutifloraBeauv.内生固氮菌进行研究.结果表明,糖蜜草中分离的内生固氮菌与产脂固氮螺菌模式菌株DSM1691的插入序列指纹图谱存在着差异;来源于糖蜜草的4株菌紧密地聚在一起,与GenBank中已知产脂固氮螺菌Azospirillum lipoferum的16S rRNA基因全序列有97%的序列相似性.初步确定糖蜜草中分离的内生固氮菌为一新类群的内生固氮菌.

联合固氮菌株分泌能力及其对燕麦的促生效应测定

测定了分离自草坪草和燕麦根际的固氮菌株的分泌植物生长素(IAA)能力及其对燕麦的促生效应.结果表明:11株固氮菌都能分泌IAA,其中加前体(色氨酸)浓度在2.16～22.3μg/mL的有9株浓度大于10μg/mL;不加前体浓度在0.81～13.8 μg/mL的有6株浓度大于10μg/mL,有6株能够溶解有机磷,3株能够溶解无机磷,且溶磷强度在58～82,μg/mL,1株既能溶解有机磷,又能溶解无机磷;试管试验中除了2株效果比对照差外,其他9株株高增加62.8%～142.8%、叶绿素增加2.78%～63.89%、地上植物量增加21.45%～150.48%、地下植物量增加2.04%～70.75%、总根长增加2.27%～41.27%、根表面积增加11.32%～84.9%;另外I 017和I 012两个菌株分泌激素能力较好,I 016菌株综合能力较好.

甘蔗器官固氮酶活性及其对接种固氮菌的响应

以巴西固氮甘蔗品种‘B1’、‘B8’和广西主栽甘蔗品种‘ROC22’和‘ROC16’为材料，通过桶栽砂培方法，研究不同品种甘蔗及接种固氮菌R16SH后不同生育期和不同器官（根、茎、叶片、叶鞘）的固氮酶活性。结果显示，4个品种甘蔗及接菌后各器官的固氮酶活性均在伸长初期或伸长盛期达到高峰，且以根和茎较高，叶、叶鞘次之；‘B1’、‘B8’根的接菌效果最佳，其固氮酶活性分别比对照增加13．22％和12．42％，而‘B1’和‘ROC16’茎的固氮酶活性分别比对照提高12．19％和12．02％，叶片提高了8％～9％，叶鞘的固氮酶活性变化最小；4个品种甘蔗固氮酶活性表现为‘B8’〉‘B1’〉‘ROC22’〉‘ROC16’，且品种‘B8’与‘ROC22’和‘ROC16’存在显著或极显著差异；相对于品种‘ROC22’和‘ROC16’，固氮菌R16SH对‘B1’与‘B8’的株高以及‘B1’的茎径有更好的生长诱导效应，且在伸长期表现最明显。研究表明，甘蔗的固氮酶活性在品种、器官及生育期间均存在明显差异，接种固氮菌能不同程度提高各品种器官的固氮酶活性，且各品种根、茎以及‘B1’和‘B8’的叶片固氮酶活性显著或极显著差异增加；巴西固氮甘蔗品种表现出比广西主栽甘蔗品种更强的固氮酶活性，且对接种固氮菌反应更敏感。

菠菜内生固氮菌的分离及其功能特性研究

内生固氮菌具有促生、病原菌的防治及生物固氮等作用,并且占据着植物组织内有利于营养供应和微环境适宜的生态位,是重要的微生物菌种资源。从菠菜根内分离筛选优势内生固氮菌7株,其中假单胞菌属(Pseudomonas)5株,红球菌属(Rhodococcus)和黄杆菌属(Flavobacterium)各1株。菌株Pseudomonas sp.BCE6和Pseudomonas sp.BC-E8固氮酶活性较高,分别为(13.19±0.32)和(12.11±0.96)C2H4nmol/(mg protein·h),与圆褐固氮菌(ACCC11103)的固氮酶活性具有极显著性差异(P<0.01);菌株Pseudomonas sp.BC-E7具有固氮酶活性[(8.42±0.03)C2H4nmol/(mg protein·h)]、产IAA能力[(59.58±4.15)μg/m L]、ACC脱氨酶活性[(5.067±0.376)μmol/(mg protein·h)],拮抗立枯丝核菌ACCC36124(Rhizoctonia solani)、麦类赤霉病ACCC36272(Gibberella zeae)等4种常见土传病害。菠菜内生固氮菌Pseudomonas sp.BC-E7是一株多功能内生菌,具有较好的生产应用前景。

玉米内生固氮菌的回接分离及限菌条件下在玉米根内的定殖

对从玉米茎内分离的 18株固氮菌进行了回接分离试验 ,经多碳源无氮培养基、菌落形态、颜色与REP PCR相结合的方法 ,筛选、鉴定出了两株具有较高乙炔还原活性和能在玉米体内定殖的菌株R1和R6 .把携带 gfp标记基因的质粒pKK2 2 3 GFP和nifH gfp的质粒pMGFP2 .1分别转化R1和R6 ,得到携带 gfp ,且菌落带绿色荧光的转化子R1A和R6A ,以及携带nifH gfp的转化子R1B和R6B .在限菌条件下对R1A和R6A在玉米根内的定殖以及R1B和R6B中nifH gfp融合基因的表达进行了研究 ,结果表明了R1A和R6A主要定殖在根的皮层细胞、胞间隙、中柱细胞和导管内 ,有时在活的细胞内也可检测到 .R1B和R6B中的融合基因因受玉米根内营养以及其它与固氮酶基因表达相关因素的限制 ,很难在玉米根内表达 ,只有在添加了 1‰蔗糖后 ,nifH gfp才能在根内表达 .图 2表 2参

1株有固氮能力的甘蔗克雷伯氏菌的分离鉴定及固氮特性

采用无氮Dbereiner培养基,从广西本地甘蔗品种桂糖28号根系分离筛选到1株高固氮活性的细菌菌株L03,对其进行形态、生理生化、16SrDNA序列的系统发育分析和固氮特性研究。结果表明,L03为植生克雷伯氏菌(Klebsiella plantica),将该菌用蛋白胨含量为0.4g/L的Dbereiner培养基培养,当培养瓶中O2含量为2mL、温度为33℃的条件下固氮活性最高,固氮百分率达29.2%。并在连续继代13次后保持固氮能力不变。

水稻根际联合固氮细菌的研究

从我国南方水稻根部分离到3株氧化型革兰氏阴性细菌,编号为A1601、A1701和A1702。经^(15)N 示踪实验证明,它们均有较高的固氮能力。在无氮培养基中加入少量稻根浸出液进行培养后,可使固氮酶活性明显提高。根据菌株的形态和生理生化等特征鉴定,3株菌均为产碱菌属的细菌,分别为争论产碱菌(Alcaligenes paradoxus A1601),反硝化产碱菌木糖氧化亚种(Alcaligenes denitrificans subsp.xylosoxydons A1701)和反硝化产碱菌反硝化亚种(Alcaligenes denitrificans subsp.denitrificans A1702)。这是继粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)之后,发现的产碱菌属中另外3株未见报道的固氮细菌。

细菌铁蛋白释放铁的动力学研究

棕色固氮菌细菌蛋白在可见光谱区中有定性的特征吸收峰。细菌铁蛋白经过量Ｎａ２Ｓ２Ｏ４还原后，该蛋白的α、β和Ｓ峰的吸光度随着蛋白还原程度增大而递增。细菌铁蛋白的氧化还原状态可分为氧化态、半还原态和深度还原态。细菌铁蛋白铁核中的磷铁组成存在着非均匀性，该蛋白释放铁核表层的铁的反应为一级反应，推测这一过程受蛋白壳中的血红素调控。细菌铁蛋白释放铁核内层的铁的反应为零级反应。

玉米联合固氮耐铵工程菌Enterobacter gergoviae-7(E7)在不同载体及玉米根际的存活规律

以草炭、腐植酸和水为载体接种玉米联合固氮耐铵工程菌Enterobactergergoviae -7(以下简称E7)制备菌剂 ,在常温条件下放置 5dE7菌数在载体内明显增加 ,1mo后E7菌数略有下降 ,2mo后E7菌数急剧下降 ,半年后E7活菌数降至n(CFU) =5 .0× 10 6～ 93.0× 10 6g- 1 ,3种菌剂中菌数的变化趋势一致 ,E7菌数残留量 :草炭菌剂 >液体菌剂 >腐植酸菌剂 ;用草炭菌剂拌种在生长 2 0d的玉米根区 (包括根系和根际土壤 ) ,E7菌数达到最大值 ,以后E7菌数下降 ,至灌浆期玉米根际未能检测到E7;不同接种方法试验结果表明 ,以草炭菌剂拌种 +种下 2cm穴施使玉米获得最高增产率 .(表 3)

Frankia基因组DNA提取及其PCR带型

本文采用溶菌酶法、CTAB法、微波（MW）法及CTAB＋MW法等4种方法提取Frankia菌CpIl基因组DNA。结果表明四种方式均可满足试验要求，其中以CTAB法及微波法最为有效。在比较提取方法与PCR带型间的关系中，发现提取上的差异不影响PCR带型的变化。

巴西固氮螺菌Yu62 draTG基因及其下游区域的定位诱变分析

用卡那霉素盒（Ｋｍｒｃａｓｅｔｅ）插入法，对巴西固氮螺菌（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）Ｙｕ６２的ｄｒａＴＧ基因及其下游区域进行了诱变，并获得相应的突变株。研究表明：ｄｒａＴ变突株的固氮酶活性不再受铵抑制，而ｄｒａＧ突变株在有铵时则丧失固氮酶活性，但当铵耗尽后却不能像野生型菌株那样恢复活性。ｄｒａＴＧ下游区域突变株ＹＺ４（突变位点距ｄｒａＧ约２ｋｂ）在无氮及限铵条件下，其固氮酶活性比野生型菌株的高，但其ｎｉｆＨｌａｃＺ转录融合子的表达并不受影响。

对从甘蔗根部分离的固氮成团泛菌的研究

从甘蔗根部分离的固氮菌株Ｗ１１，经细菌自动鉴定系统根据９６个生化试验指标，鉴定为成团泛菌。该菌株耐酸（ｐＨ３．５），耐高蔗糖浓度（３０％），产酸使培养基的酸度降低到ｐＨ４．４１，３．１ｍｍｏｌＮＨ４ＮＯ３或５８．８ｍｍｏｌＮａＮＯ３能抑制固氮酶活性。在培养基的蔗糖浓度为１０％，谷氨酸钠０．２５ｇ／Ｌ，ｐＨ５．５，２８～３０℃条件下，该菌株生长最佳，固氮酶活性最高。在耐高蔗糖浓度，耐酸，碳源利用。

自生固氮菌的分离鉴定

从非豆科作物根际土壤中分离筛选得到 ２１３ 个在无氮培养基上能良好生长的菌株，通过酶活测定，从中筛选得到 １８ 株固氮能力较强的菌株，并对其中酶活最高的 ４ 株菌株进行了鉴定，结果表明它们属于固氮菌科的不同属。利用它们可望制成适合于不同农作物生长的生物复合肥。

Frankia菌在非豆科放线结瘤植物根际内的存活与分布

提取Ｆｒａｎｋｉａ菌１６ＳｒＲＮＡ，制备具专一性的寡核苷酸探针，通过同源杂交，在人工接种的木麻黄根际内检测出痕量Ｆｒａｎｋｉｓ菌结果表明，Ｆｒａｎｋｉａ可在环境因子的作用下被动迁移不论接种点的位置如何，经６个月的时间稳定后，其分布状态基本相同。

固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021接合转移系统的建立及优化

【目的】建立和优化固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021(简称菌株WZS021,下同)的接合转移体系,以丰富固氮链霉菌基因片段转移技术。【方法】以大肠杆菌Escherichia coli ET12567(pUZ8002)为供体菌,携带整合型质粒pSET152的菌株WZS021为受体菌,进行菌株WZS021接合转移。【结果】选择高氏一号培养基为菌株WZS021接合转移培养基,50℃热激10 min,供受比为1∶10,涂布20.0 mg/L安普霉素、接合转移12 h后覆盖抗生素,添加MgCl_2终浓度为5.0 mmol/L时接合转移效率最高,达3.24×10^(-6)。【结论】通过确定适用于菌株WZS021接合转移条件建立的菌株WZS021遗传转化体系,有助于今后插入标记基因确定该菌的固氮定殖位点及导入外源基因的操作。

玉米根系联合固氮菌分离鉴定与应用效果

从河北省农田采集玉米根系样品,经表面消毒后,分离得到固氮酶活性较高(2780—4880 nmol C_2H_4·g^(-1)鲜菌体·h^(-1))的4株细菌m-111、m-112、m-230、m-254。经细胞形态、培养特征、生理生化特性、DNA 中 G+C 克分子含量测定等方面研究认为,这4株菌应归属于克雷伯氏菌属土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)。将这四株菌分别培养制成液体菌剂,回接玉米,结果表现出不同程度地促进玉米生长发育,提高单位面积产量,其中m-111、m-230菌株亩增产51.9kg 和63.8kg,增产率分别为11.7%和14.4%。经生物学统计,不仅与不接菌玉米相比,而且在接不同菌株间产量的差异也达到极显著标准,是很有应用价值的菌株。