噬菌体6肽随机表面表达文库的构建

体外合成编码６肽的随机ＤＮＡ片段以及用于随机ＤＮＡ片段扩增的一对ＰＣＲ引物，再经ＰＣＲ扩增、ＢｇｌＩ酶切扩增产物，获得编码６肽的随机ＤＮＡ克隆片段，并利用已构建的噬菌体表面表达载体（ＦＵＳＥ５）的特性，将随机ＤＮＡ克隆片段与ＦＵＳＥ５载体连接，连接物电转化ＭＣ１Ｏ６１宿主菌，经抗性和插入复活筛选，获得１．６ｘ１０８个独立克隆。构成文库的克隆经酶切、ＰＣＲ扩增、斑点杂交、序列测定、亲和素富集等方法的综合鉴定和评定，以及６肽随机克隆体外增殖和表达特性观察，结果均表明，我们已成功构建了编码６肽的噬菌体随机表面表达文库。对原库作不同批次连续扩增所获扩增库，又进一步证实，已构建的原库具备以质粒和丝状噬菌体二种形式在体外稳定增殖的特性。

噬菌体表面表达技术及其在抗病毒研究中的应用现状和前景

噬菌体表面表达技术及其在抗病毒研究中的应用现状和前景张英李爱民（中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室，北京１０００５２）噬菌体表面表达技术（ＰｈａｇｅＤｉｓｐｌａｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰＤＴ技术），是由美国Ｍｉｓｏｕｒｉ大学Ｓｍ...

原噬菌体PBSX阻遏基因及其温度敏感型等位基因的克隆分析

本研究利用聚合酶链式反应技术，成功地克隆了枯草芽孢杆菌缺陷型原噬菌体ＰＢＳＸ阻遏基因及其温度敏感型等位基因。核苷酸序列分析发现，野生型及其温度敏感型阻遏基因之间的碱基变异较大，但却存在几乎完全相同的开放读框，尤其是开放读框ｏｒｆⅠ，可能编码着１１３个氨基酸的阻遏蛋白，并且还推定了开放读框的启动区和核糖体结合位点。通过互补实验，证实了野生型阻遏基因的产物能够抑制温度诱导ＰＢＳＸ原噬菌体，表明克隆的基因有着正常的生物活性。

噬菌体φHAU3的cos位点及其与寄主相互作用的功能位点attP和attB的定位

ＨＡＵ３是寄主范围很广的放线菌噬菌体。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交实验表明，ＨＡＵ３可以整合到吸水链霉菌应城变种１０－２２和变铅青链霉菌６６的突变体ＺＸ１的染色体中，形成溶原，其溶原菌自发释放ＨＡＵ３，不受热激和紫外线照射的诱导。通过比较ＨＡＵ３衍生噬粒ｐＩＪ８３００的ＤＮＡ酶切片段在加热前、后电泳带谱的区别，将ＨＡＵ３的ｃｏｓ位点在ｐＩＪ８３００的图谱上得到了定位。还利用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的方法定位了ＨＡＵ３与宿主形成溶原时附着位点（ａｔｔＰ），并利用脉冲电泳技术定位了在变铅青链霉菌ＺＸ７和吸水链霉菌应城变种１０－２２中形成溶原的附着位点（ａｔｔＢ）。这些信息均有利于以ＨＡＵ３为基础的载体的发展和优化。

nutR中的突变对λ噬菌体早期转录抗终止作用的影响

将λＤＮＡ的ｎｕｔＲ序列置于Ｌａｃ启动子的下游，在ｎｕｔＲ和β－半乳糖苷酶基因（ｇａｌＫ）之间插入λ噬茵体依赖ｒｈｏ的终止子ｔＲ１，使ｇａｌＫ的表达取决于Ｎ蛋白介导的转录抗终止作用。为研究ｎｕｔＲ对抗终止的影响，系统地进行了该序列中每个碱基的点突变（Ａ→Ｃ，Ｇ→Ｔ，Ｃ→Ａ及Ｔ→Ｇ）．结果表明ｂｏｘＡ中有两个碱基（位置２和５）的突变对抗终止作用是至关重要的，使抗终止效率降低了１０倍；而其他位置的改变影响甚微。ｂｏｘＡ的缺失在ｎｕｓ￣＋宿主中使抗终止数率降低了４０％，但在ｎｕｓＢ宿主中却恢复到野生型水平。ｂｏｘＢ茎环结构中，茎部顶端的碱基对及环中邻近茎部的两个碱基的突变对抗终止作用影响很大，被认为是Ｎ蛋白的识别序列．ｂｏｘＡ和ｂｏｘＢ之间的间隔序列中有两个碱基的突变几乎使抗终止作用丧失。

利用重组噬菌体诱导表达的大肠杆菌表达系统

将编码噬菌体T7RNA聚合酶的基因克隆至噬菌体M13mp18RF DNA中,置于lac启动子的控制之下,得到了可表达T7RNA聚合酶的重组噬菌体M13HEP。利用该噬菌体感染含T7启动子表达质粒的宿主菌以提供T7RNA聚合酶,可以诱导T7启动子控制下的外源基因的表达。该噬菌体诱导表达系统已成功地表达了多种外源基因,特别是一些表达产物对宿主菌有毒性的基因。同时,通过细菌接合将F＇因子从大肠杆菌XL1-blue转至大肠杆菌HMS174,构建了新的大肠杆菌菌株HMS174F＇,使得T7表达质粒构建、表达及单链制备可以在同一菌株中完成,得到了一个完整的T7表达系统。

栗疫菌低毒力dsRNA与真菌病毒dsRNA的序列同源性

以我国栗疫菌［Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ（＝Ｅｎｄｏｔｈｉａ）ｐａｒａｓｉｔｉｃａ］低毒力菌株ＥｐＣ１４０（广西）的［γ─￣３２Ｐ］ＡＴＰ末端标记ｄｓＲＮＡ作探针，与５种真菌病毒ｄｓＲＮＡ进行分子杂交。探针可与紫孢侧耳病毒（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｓｅｐｉｄｕｓｖｉｕｓ）和小麦全蚀菌病毒（Ｇａｅｕｍａｎ─ｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ·ｖｉｒｕｓ）的ｄｓＲＮＡ杂交，但不能与黑曲霉病毒（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｖｉｒｕｓ）、产黄青霉病毒（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｖｉｒｕｓ）和稻瘟菌病毒（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａｏｒｙｚａｅｖｉｒｕｓ）的ｄｓＲＮＡ杂交。当以低毒力菌株ＥｐＣ３２（云南）作探针时，结果相同。

产谷氨酸菌转导的研究

研究了一株 Brevibacterium tientsinenensT6-13 温和噬菌体φT4的转导。结果表明:φT4能够以10^(-7)左右的频率转导不同的营养缺陷标记;首次发现,L-色氨酸能够有效地提高转导频率,紫外线照射噬菌体对Thr和Cys基因的转导有相似的影响,即随着紫外线照射时间的延长,完全转导子出现的频率先上升而后下降;通过共转导的测定发现了T6-13的一个基因连锁群,基因顺序是 cys-thr-met。

枯草芽孢杆菌噬菌体载体的构建

以φ105DI:1t为原始株构建的重组噬菌体φ105S35和φ105S36具有自主侵染能力和溶源化特征。其基因组内插入的1kb片段上的cat,基因赋予二者所在宿主以氯霉素抗性。在两株噬菌体中插入位点相同,即原φ105DI:1t的SmaI酶切片段D、E之间,但插入片段在二者中的定向相反。与 cat 基因同时引入的单一 BamHI 和 XbaI 位点提供了外源 DNA 的插入位置。重组噬菌体 DNA 可高效转染枯草芽孢杆菌原生质体。因此φ105S35和φ105S36可作为枯草芽孢杆菌系统的载体而被利用。

P_4噬菌体——一种卫星噬菌体的特性及其DNA的研究

本实验观察了P4噬菌体在大肠杆菌C117中的增殖过程。该噬菌体在60℃几乎完全被灭活,对紫外线有抗性,对乙醇和EDTA溶液敏感。用电镜和琼脂糖凝胶电泳对其DNA进行分析提示,P4噬菌体中除含一般的双链开环和线性DNA外,在未完全成熟时它的头部衣壳中还有一种复杂的不均一打结DNA,这种特殊构型DNA的发现将为DNA拓扑异构酶Ⅱ的鉴定及酶活力测定奠定基础。

变铅青链霉菌对噬菌体φHAU3抗性与异常修饰之间的相互关系

变铅青链霉菌异常修饰突变菌株ＺＸｌ同时丧失了对噬菌体ＨＡＵ３的抗性，遗传学杂交结果揭示，ＤＮＡ降解和对ＨＡＵ３抗性这两种表型从不发生分离。以ＺＸｌ为宿主和链霉菌低拷贝质粒ＳＣＰ２衍生的载体ｐＩＪ９２２为载体，构建了变铅青链霉菌ＪＴ４６的基因组文库。在８０００多个转化子中获得了一个能使ＺＸ１对ＨＡＵ３显示抗性的杂合质粒，命名为ｐＩＪ８３１０。它除了含有完整的ｐＩＪ９２２外，还携带了大约１１ｋｂ的外源片段。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实，这个外源片段来源于ＪＴ４６，但在ＺＸ１中完全消失。利用转座子Ｔｎ４５６０对该克隆进行诱变定位，获得了中断噬菌体抗性基因表达的衍生质粒，并已证实Ｔｎ４５６０插入在一个２．５ｋｂ的ＢｄｍＨＩ一ＥｃｏＲＩ片段上。

变铅青链霉菌66中对噬菌ΦHAU3显示抗性的基因（ψHAU3￣R）的核苷酸定序和分析

杂合质粒ｐＩＪ８３１０是链霉菌低拷贝质粒ｐＩＪ９２２１携带了１０．８ｋｂ来自变铅青链霉菌ＪＴ４６菌株，编码对噬菌体ΦＨＡＵ３抗性的ＤＮＡ片段。已知Ｔｎ４５６０插到该克隆中３ｋｂ的ＥｃｏＲＩ或３．３ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段（这两个片段之间有２．５ｋｂ的重叠区）上，中断了ΦＨＡＵ３抗性基因的表达。已将３．０ｋｂ的ＢｃｏＡＩ片段分别以两种不同的取向克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）上。核苷酸序列分析揭示出一个１．３ｋｂ的ＯＲＦ的存在，其所编码的４７８个氨基酸组成的蛋白与λ噬菌体的ｅａ５９基因所编码的氨基酸序列显示了高度的同源性，其氨基酸序列的同一性高达３７％，相似性达５８％，而λ噬菌体的ｅａ５９基因是编码赖ＡＴＰ和单键ＤＮＡ的核酸内切酶Ｉ的，该区域与λ的复制无关。此外，这段具有高度同源性的ＤＮＡ区域的Ｇ＋Ｃ％只有６０％，低于变铅青霉菌ＤＮＡＧ＋Ｃ％的平均值（７４％）。