酿酒酵母超氧物歧化酶(SOD)基因的克隆和表达

通过PCR扩增技术从酿酒酵母中得到了Cu,Zn-SOD的结构基因,此基因被亚克隆到大肠杆菌质粒载体pT7-7,得到重组质粒pT7-7::SOD。利用EcoRI和PstI酶切pT7-7::SOD质粒,经琼脂糖凝胶电泳,DEAE-滤膜回收Cu,Zn-SOD结构基因片段,将其亚克隆到M13中,并转化大肠杆菌,得到了重组质粒M13::SOD。酶切和纯化后的SOD基因,定向克隆到酵母质粒载体pHZ-8的Smal和EcoRI位点上,构建成重组质粒pHZ-8-1。经转化酵母受体菌ZH-1和DP-1后得到了转化子,来自于ZH-1的转化子在非选择性条件下培养40世代后仍有95％以上细胞保留重组质粒。而来自于DP-1的转化子很不稳定。经蛋白提取、聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶活性测定结果表明,来自于ZH-1转化子中SOD的表达量约为细胞可溶性蛋白的15％,并具有生物活性。

白僵菌菌种退化及其控制

以菌落局交作为球孢白僵菌菌种变异的标志，研究了２个野生型菌株及由其分离的８个单孢株在继代培养中的变异现象。同时探讨了８种培养基，６种氮源，１５种碳源，８种ｐＨ，不同温、湿度、先照平时菌种稳定性、产孢量、毒力的影响。结果显示：白僵菌的变异主要受控于菌株本身的遗传物质。常见的８种培养基以营养贫乏的ＰＤＡ、ＳＤＡ、ＣＭＡ最易发生变异，ＳＤＡＹ较稳定；氮源是影响菌落局变的最主要因子，在供试的６种氖源中，动物性氮源较植物性氮稳定，蛋白胨最优，植物性氮源中麦麸稳定性优于米糠、黄豆粉；碳源（除菊糖外）、Ｃ／Ｎ、ｐＨ对菌株稳定性影响不明显；低温、低湿、全光照下引起的变异最低。

球孢白僵菌菌种退化及其对马尾松毛虫防治的影响

球孢白僵菌继代培养中通过菌落局变产生不同类型分离株。本试验检测结果显示此类分离株多表现为产孢量下降、生长速率增加、毒力降低等与生产性状退化类似的变异现象。少数产孢量高、毒力强的分离株，固其生长速率慢即在培养中被掩盖而消失，并据此推断出继代培养次数对该菌退化速率的影响。提出了控制该菌菌种退化的有效措施。

绿色木霉纤维素酶CBHⅡ基因的结构研究

实验经限制性酶切和双向Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交将重组质粒ｐＣＢＨＩＩ－１４的１４ｋｂ外源片段上的绿色木霉纤维素酶ＣＢＨＩＩ基因定位于４．４ｋｂ的ＥｃｏＲＩ片段上，将该片段克隆于质粒ｐＵＣ１９，获得重组质粒ｐＣＢＨＩＩ。通过限制性分析构建了ｐＣＢＨＩＩ上４．４ｋｂＥｃｏＲＩ片段的物理图谱。在此基础上用质粒制作该片段的亚克隆，采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定了含绿色木霉纤维素酶ＣＢＨＩＩ基因的４０７４ｂｐ的ＤＮＡ序列，由ＧＴ－ＡＧ规则和ｃＤＮＡ序列推知该结构基因由４个外显子和３个内含子组成，总长１６１３ｂｐ，５′端存在与一般真核基因类似的两个特征性调控序列，但３′端不存在真核基因通常具有的特征序列而存在功能未明的短重复序列和嘧啶富集区。并对纤维素酶基因间的同源性和可能的功能作了初步的探讨。

原生质体电融合构建酵母多倍体的研究

为考察将STA基因导入酿酒酵母的可能性和研究糖化酵母在不同核倍性下STA基因的表达效应,从酿酒酵母HU-TY-1A及糖化酵母5101-7C、5206-1B、5301-14D出发,通过原生质体电融合技术,构建了11株核倍性分别为2n、4n、5n及8n的酵母多倍体.所用电融合参数为:交变电场强度200v/cm,频率1MHz;电脉冲强度9kv/cm,宽度40μsec,脉冲数2个,间隔10sec,波形为方波.在糖化酵母单一亲株融合组合中,融合株检出采用菌落形态作为初检指标取得一定效果.其它融合组合则采用遗传标记检出更为可靠.所得融合率约为5×10^(-5)—1×10^(-3).所有融合株经15代以上传代培养,遗传稳定.

嗜热真菌 Thermomyces lanuginosus热稳定a—淀粉酶的纯化及特性

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus在液体培养基中于50℃静止培养14d,培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析、SephacrylS-300分子筛层析和FPLC MonoQ离子交换层析,得到了凝胶电泳均一的淀粉酶。纯酶与淀粉反应不同时间后,用碘色反应法和DNS法测定淀粉和还原糖量,结果显示淀粉量在开始时迅速下降,但还原糖的量却增加很慢;产物经TLC层析分析为麦芽糖和少量葡萄糖。由此说明它为α-淀粉酶。用SDS-PAGE和Sephacryl S-300分子筛层析测定分子量为56000,不具亚基。酶反应最适温度和pH分别为65℃和4.5～5.0。在pH4.6条件下,酶在50℃是稳定的;60℃保温1h,仍保留94％的原酶活性;酶在70℃的半衰期为10min。钙离子对酶有激活作用。酶对糖原和糊精有一定的水解能力。

以潮霉素抗性为选择标记的稻瘟病菌原生质体转化

稻瘟病菌对潮霉素（ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ，简写为ＨｍＢ）较为敏感，当不含无机盐的再生培养基中ＨｍＢ浓度达到１００μｇ／ｍｌ时，稻瘟病菌２５３９ｗ原生质体的再生即被完全抑制。我们利用带有ＨｍＢ抗性基因的质粒（ｐＡＮ７－１），通过ＰＥＧ②融合法对其原生质体进行转化，获得了ＨｍＢ抗性转化子。转化子以两类形式出现：一类为大而生长稳定的菌落，另一类为小而生长不稳定的菌落，两类菌落产生频率分别为每μｇＤＮＡ３－４个和１０－２０个。将大菌落转化子转接到含有ＨｍＢ的新培养基上，仍可正常生长，但小菌落转化子却不能，说明前者为真正的转化子而后者为流产转化子。ＤＮＡ杂交分析显示转化是由于质粒ＤＮＡ整合到了２５３９ｗ的染色体ＤＮＡ上，整合可在染色体ＤＮＡ的不同位点上发生。受试的７个转化子尽管各自的整合形式不同，但均在选择与非选择性培养中保持稳定。

紫外辐射对球孢白僵菌的影响及适宜保护剂的选择

本研究考查了２８０～４００ｎｍ范围的紫外光对球孢白僵菌分生孢子的影响。结果表明，孢子对２８０ｎｍ的紫外光极为敏感，照射６ｈ后，杀伤率达到５５．６０％。在供试的Ｏｘｉ－ｆｅ、Ｗ－ｔｉ和Ｂｌ－ｃ三种紫外保护剂中，以Ｏｘｉ－ｆｅ为最好，２８０ｎｍ下照射５ｈ．孢子的萌发率同未经照射孢子无显著性差异。将Ｏｘｉ－ｆｅ同白僵菌孢子分别以１：１０、２：１０和４：１０的比例混和。２８０ｎｍ下照射５ｈ，各处理间孢子的萌发率无显著性差异，４：１０的比例同未经照射孢子的萌发率没有极显著性差异。

黑曲霉原生质体的形成、分离与再生的研究

本文研究了从黑曲霉中获得原生质体的各种条件(例如渗透压稳定剂、温度、菌龄,培养基的成分、酶系统等)。结果表明,采用0.5％蜗牛酶和1％纤维素酶的混合溶液酶解菌丝体,可获得大量的原生质体。该原生质体用0.8mol/L NaCl作为渗透压稳定剂在再生培养基上再生率为50％。

臭曲霉(Aspergillus foetidus)启动子H8片段克隆及其序列

使用原核及真核菌通用的挑选启动子克隆载体 pJGI,从臭曲霉菌体总 DNA 中分离到具有较好活性的启动子 H8片段。根据 Southern blot 证明该启动子来自臭曲霉菌;H8全片段 DNA 序列分析结果表明其含有750bp,内含典型真核启动子功能序列(TA TA box)及增强子 GTGG TTT AAA G 的相似序列,分析证实是一个新的臭曲霉启动子。初步实验表明该启动子不但在臭曲霉菌内有启动功能,并第一次证明来自臭曲霉菌的启动子在原核细胞中也具有启动子活性,能够表达完整的 Lac Z 基因。

黑曲霉糖化酶高产菌株的糖化酶结构基因的分离及其序列分析

从糖化酶高产菌株(Aspergills niger)T21中分离出染色体DNA.Southern印跡分析表明糖化酶结构基因位于约2.5kb的EcoRⅠ-EcoRV片段中.该染色体DNA经EcorⅠ、EcoRⅤ完全酶切后,用琼脂糖凝胶电泳分离,回收2.0—3.0kb的片段,与载体pBR322连接后转化宿主菌大肠杆菌DH5,获得转化子.通过原位杂交,从转化子中筛选出4个阳性克隆.阳性克隆的进一步酶切鉴定及序列分析表明,黑曲霉T21糖化酶结构基因大小为2.3kb,含有4个内含子.

球孢白僵菌不同菌株生物学特性的研究

在萨氏与虫粉两种培养基以及１％葡萄糖液和２％虫尸滤液两种营养液中，对４４株球孢白僵菌的菌落形态、菌丝生长、产孢量、孢子萌友情况以及孢子在不同湿度下储存一年的发芽率、抗紫外线能力和生物测定等方面进行了试验。结果表明：菌落形态可分为三种类型；在两种培养基上，菌丝生长特别快的反而产孢量低，或不产孢；不同湿度下存放一年，湿度为３３％和５５％时分别有７３．８％和８５．９％的菌株不发芽，当温度为７６％和９２％时供试菌株全部不发芽；２％虫液中孢子的萌发速度快，萌发率高；经紫外线处理后９１．３％的菌株菌落生长半径减小；有５９．４％的菌株僵虫率在５１％以上。

赤霉素产生菌——藤仓赤霉菌融合重组的研究

以一对营养互补的缺陷型突变株作为亲本,酶法去除细胞壁制成原生质体,以等量相混,用30%PEG 4000诱导融合,在最低营养再生培养基上直接选择原养型融合重组子,重组频率约为10^-,同时产生一定数量的不稳定异核体,频率约为10^(-5)—10^(-6).融合重组导致色素产生和菌丝形态及赤霉素产生能力的多种变异.融合重组子中赤霉素产量的正变率为15.3%.其中RN2和RG14菌株的赤霉素产量比原养型出发菌株207提高25%以上.

真菌高分子量核DNA的提纯

目前,提取真菌核DNA的方法常用的有两种。一种是先制备原生质体,再从中提取核DNA;另一种是先用密度梯度超离心法提取粗核,再从粗核中提DNA。用这些方法虽能获得高分子量的核DNA,但操作均太繁琐,且对所用试剂和仪器要求较高。schwartz等建立了一种采用脉冲电泳技术分离巨大DNA分子的方法。

克鲁维酵母种间原生质体融合的研究

乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis Y12-1)和脆壁克鲁维酵母(K.fragilis8554)是乳糖酶生产菌株。应用原生质体融合技术进行了两菌株种间融合的研究。通过试验,原生质体形成及再生的最佳条件为:对数期的细胞,2％的蜗牛酶,30℃酶解30分钟,原生质体形成率90％以上,再生率20％左右。原生质体融合由聚乙二醇(PEG)诱导。K.lactisY12-1不能发酵菊糖;K.fragilis8554不能同化D-松三糖和麦芽糖。利用二菌株自身的营养缺陷性质获得融合子。融合子既能发酵菊糖又能同化D-松三糖和麦芽糖;融合子的DNA含量约为二亲株之和;融合子的菌落形态与亲株相比有一定差别;在以乳糖为碳源的培养基中,融合子的乳糖酶产量提高14—16％;连续15次传代,融合子稳定。

通过原生质体融合改建酵母细胞的研究——Ⅴ.酿酒酵母与糖化酵母种间融合杂种的遗传分析

HU-KDP-185菌株是由单倍体糖化酵母与二倍体椭圆酿酒酵母经原生质体融合而获得的种间三倍体融合杂种。遗传分析表明,该杂种在遗传上是稳定的;在一般情况下,其产孢率为13.54%;但在特定预培养条件下,可提高到38.61%,即使在只含0.98%醋酸钾和0.186%KCl的HU-Li简易产孢培养基上,其产孢率也可达33.23%。用显微操作器解剖了202个4孢子子囊,得到376个四分子单孢株,其孢子成活率达46.53%;四分子的交配型出现A、a、AA、aa4种类型,没有发现有AAa交配型存在。四分子发酵可溶性淀粉的能力为1:2(发酵:不发酵);而遗传标记的分离比为野生型:营养缺陷型(包括hisˉ,argˉ,hisˉargˉ)约为1:1。

三角酵母二倍体菌株的选育

由三角酵母(Trigonopsis variabilis)原生质体融合,获得了35株原养型融合子。通过对其中四株进行详细分析表明,融合子细胞体积和 DNA 含量为两亲株之和,苏木精染色显示单核,这些结果证明融合子为亲株的二倍体。此外,融合子的生长速度、D-氨基酸氧化酶以及细胞蛋白质含量均明显高于亲株。电镜形态观察进一步证明融合子细胞大于亲株。

酿酒酵母α-磷酸甘油脱氢酶变异株的鉴定及其高渗敏感性状的遗传分析

本室检测到一株酿酒酵母α-磷酸甘油脱氢酶(α-glycerophosphate dehydrogenase,简称α-GPD)变异株,在所试条件下,变异株的α-GPD酶活比野生型菌株低5倍多。遗传分析表明,该变异株的α-GPD变异是由单一结构基因发生突变,使其所编码的α-GPD分子的构象发生变化而导致酶活显著下降,这也就使它在高渗条件下不能正常生长而表现为高渗敏感菌株。但在一般培养条件下,变异株的呼吸能力、生长量和发酵力与野生型菌株均无明显差异。此外,本文还对酿酒酵母的α-GPD活性与高渗敏感性状的关系进行了讨论。

酵母菌属间原生质体融合：构建高产麦角固醇的优良品系

采用属间原生质体融合技术，对麦角固醇含量较高、细胞生物量低的裂殖酵母（Ｓｃｈｚｉｏｓａｃｃｈ－ａｒｏｍｙｃｅｓ）单倍体ＹＧ－１－１４－５８（ａｍｅｔ￣－ｔｒｐ￣－）与细胞生物量较高、麦角固醇含量低的酿酒酵母（Ｓｕｃｃｈ－ａｒｏｍｙｃｅｓ）单倍体ＹＧ－２８－３２－１３５（ａａｄｅ￣－ｈｉｘ￣－）进行原生质体融合，在高渗基本选择培养基上挑选融合子，并对获得的大量融合子进行了形态、生理生化、遗传稳定性、细胞生物量及麦角固醇含量等分析，从中选育出高产麦角固醇的优良品系Ｆ－Ⅱ－３７和Ｆ－Ⅲ－１０２。