RT-qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平方法的建立

目的建立实时荧光定量(RT-qPCR)检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)基因转录水平的方法,以在转录水平上对XDH/XO基因进行定量检测。方法提取Wistar大鼠肝脏组织中总RNA,经逆转录得到cDNA,以10倍为稀释因子稀释为5个浓度梯度,使用设计的引物序列和内参基因进行RT-qPCR检测,得到XDH/XO基因表达的标准曲线。进而检测Wistar大鼠高尿酸血症动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结果 RT-qPCR法检测得到的XDH/XO基因标准曲线溶解峰单一,R^2接近1,能检测出高尿酸动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结论 RT-qPCR检测Wistar大鼠XDH/XO基因转录水平的方法具有定量准确,重复性好的特点,可应用于高尿酸血症的发病机理、新药研究等方面。

人绒毛膜促性腺激素β-亚基基因疫苗在动物肌肉组织中的表达

为观察pCMV4-hCGβ重组质粒经肌肉途径接种后在宿主体内的表达,本实验以昆明小白鼠为实验材料,将实验组鼠经后腿股四头肌注射重组质粒pCMV4-hCGβ100μg,对照组注射pCMV4100μg,于接种后第7d和第30d取小鼠股四头肌免疫组化染色.结果显示,在注射部位肌肉的肌膜和肌间隙处见到棕褐色分泌颗粒,对照组则未见阳性颗粒.本研究探索了hCGβ基因导入小鼠骨骼肌并在肌肉组织内进行表达的情况,为hCGβ基因疫苗的研制提供了体内表达的依据.

CRISPR-Cas系统在生物学研究中的应用

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,简称为CRISPR)系统是一种新的基因修饰技术,具有制作周期短、成本低和作用高效等优点。本文从结构、研究历史、分类和分布、作用机制和其在生物学研究中的应用等方面介绍CRISPR-Cas系统。

负压处理梯度电泳凝胶对PCR-DGGE实验结果的影响

目的比较负压处理前后变性梯度凝胶电泳(DGGE)胶凝固时间的变化,验证负压处理是否影响PCR-DGGE实验结果。方法使用两种不同引物扩增的PCR产物,在不同的负压处理前后,分别进行两种上述PCR产物的变性梯度凝胶电泳。结果 1)不同的负压处理对变性胶的凝固时间没有明显的影响;2)不同负压处理前后,对PCRDGGE的实验结果有明显的影响。结论负压处理对PCR-DGGE的实验结果有显著影响。

8周有氧运动对孤独症小鼠核心行为的改善作用

目的探讨8周有氧运动对丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)诱导的雌雄孤独症小鼠核心行为的改善作用。方法将实验动物随机分为对照组(CTL)、丙戊酸诱导孤独症组(VPA)和VPA+有氧运动组(VEX),每组10只。孕鼠在E12.5时腹腔单次注射VPA,其子代可作为孤独症模型。子鼠出生28 d后开始有氧运动训练。运动结束后次日通过行为学检测方法考察小鼠进行社交能力、重复刻板行为、认知和学习记忆能力、探索行为、情绪等。结果CTL组小鼠与社会伙伴互动时间长,对新社会伙伴有明显社交倾向(P<0.01);VPA组雌雄小鼠对新旧社会伙伴均无明显差异;有氧运动可显著改善孤独症小鼠这一缺陷。与CTL组相比,VPA组小鼠认知指数、目标象限停留时间、穿台次数、中心区域活动距离、开放臂停留时间和白箱活动的距离、时间均显著性降低(P<0.01),而寻找平台潜伏期,埋珠颗数和自梳理时间均显著性增加(P<0.01);与VPA组相比,VEX组小鼠在有氧运动干预后认知指数、目标象限停留时间、穿台次数、中心区活动距离、开放臂停留时间均显著性增高(P<0.05),埋珠颗数和自梳理时间显著性降低(P<0.01,P<0.05)。结论孤独症小鼠存在社交和认知能力障碍、重复刻板行为、活动量下降和焦虑情绪现象。8周有氧运动可改善孤独症小鼠社交和认知能力,缓解刻板重复行为,提高活动量,积极调节焦虑情绪。推测有氧运动在孤独症的运动康复中具有重要作用,可能为临床研究提供理论基础。

木犀草素通过抑制URAT1与调节Nrf2/HO-1通路改善尿酸诱导的肾脏损伤

为了探讨木犀草素改善尿酸性肾病(hyperuricemic nephropathy,HN)的可能机制,通过14C尿酸摄取实验测定木犀草素对尿酸转运体1(uric acid transporter 1,URAT1)尿酸转运活性的影响;采用MTT法评价木犀草素对高尿酸诱导的小鼠肾小管上皮细胞损伤的保护作用;采用氧嗪酸钾联合腺嘌呤制备小鼠HN模型,测定血清尿酸、肌酐(creatinine,CR)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)与谷胱甘肽(glutathione,GSH)的水平;借助H&E染色与Masson染色分别观察小鼠肾组织的病理学变化与纤维化情况;通过qRT-PCR检测肾脏URAT1、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-cadherin、核因子E2-相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)和血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的mRNA表达水平;通过蛋白质免疫印迹法检测肾脏URAT1、Nrf2和HO-1的蛋白质表达水平。^(14)C尿酸摄取实验结果显示,木犀草素能剂量依赖性地抑制URAT1转运14C尿酸,其IC50值为23.42μmol/L;MTT实验结果显示,木犀草素能明显改善高尿酸诱导的细胞损伤;体内实验中,与模型组相比,木犀草素能降低模型小鼠血清尿酸、CR、BUN水平,下调肾脏URAT1的mRNA与蛋白质表达水平,并通过影响TGF-β、α-SMA、E-cadherin改善肾脏纤维化,通过上调Nrf2/HO-1通路降低肾脏氧化应激水平。总之,木犀草素可通过抑制URAT1降低血清尿酸,并通过Nrf2/HO-1通路依赖的抗氧化应激反应显著改善肾损伤和纤维化。

丁香酚对褐菖鲉的麻醉效果

【目的】探究丁香酚对标志规格褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)[体长(88.12±4.87)mm]的麻醉效果,为褐菖鲉标志放流技术提供参考依据。【方法】设置10~180 mg/L共12个丁香酚质量浓度组进行实验,观察不同浓度下鱼体可达到的最终麻醉阶段,初步筛选出适宜的浓度范围,依据麻醉复苏时间以及复苏率进一步确定有效麻醉质量浓度,在此基础上进行空气暴露实验比较研究。【结果】褐菖鲉在大于30 mg/L质量浓度中可在3 min内达到Ⅳ期麻醉,在小于80 mg/L质量浓度中麻醉5 min未出现死亡及明显应激反应,初步筛选得到适宜浓度范围为30~80 mg/L;参考常用有效麻醉质量浓度选定标准,结合复苏实验得到褐菖鲉有效麻醉浓度为40~50 mg/L,此时褐菖鲉可在3 min内入麻、7 min内复苏、麻醉15 min后成活率100%;褐菖鲉在小于150 mg/L溶液中麻醉5 min全部存活,麻醉5 min以上时多组出现死亡;在40 mg/L浓度下进行空气暴露实验,15 min时平均复苏时间最短,之后平均复苏时间随空气暴露时间的延长逐步增加,由此认为在空气中15 min时褐菖鲉已复苏,为尽量避免鱼体应激,应在15 min内完成离水实验操作。【结论】丁香酚对标志规格褐菖鲉的适宜麻醉浓度为40~50 mg/L,离水操作应控制在15 min内,若需快速麻醉可选用50~150 mg/L丁香酚,并控制麻醉时间在5 min内以免造成麻醉致死。

关于过量的砷对小鼠的有害影响的综述

砷是一种常见的环境污染物,并且对人类有毒性,由此引发了人们对其的广泛研究。学术界对砷的研究由来已久,主要集中于其在动物机体内产生的化学反应、其毒性对人类健康的影响以及其在环境中检测与评估方法等领域。其中,砷的毒性机制是受关注的话题,但目前对其系统的归纳、分析和未来展望方面存在一定的研究空缺。为此,本文首先简要总结了砷的研究现状,然后以小鼠为例,综述了砷对肝脏、脾脏、肾脏、雄性生殖系统和心脏五个器官的重要影响,最后,我们概述了上述研究的重要问题,以促进我们加深对重金属毒性机制的理解。

流式细胞术检测虾类血细胞活性氧含量方法的建立

建立和优化了流式细胞术检测虾类血细胞活性氧含量的方法。以2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)为ROS特异探针,以斑节对虾(Penaeus monodon)血细胞为材料,用流式细胞仪检测不同染料浓度和不同染料孵育时间下血细胞的荧光强度、细胞形态特征和细胞活性的变化。结果表明,利用FCM检测虾类血细胞ROS含量的适宜的染料浓度和最佳的孵育时间分别为10μmol/L和30 min。

中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR方法的建立和优化

根据GenBank中卤虫actin基因的保守区域序列设计并合成一对引物,采用SYBR GreenⅠ作为染料建立了实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)方法.以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,其相关系数达到了0.999.溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰,Tm为83.6℃.结果表明:本实验建立的中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR法扩增效率高、特异性强、线性范围广、检测周期短,为actin基因作为内参基因进行卤虫早期胚胎发育基因表达的定量分析奠定了基础.

脑组织切片免疫组化技术中漂片法与贴片法效果比较

目的探讨脑组织切片免疫组化技术中漂片法与贴片法的效果。方法建立大鼠大脑中动脉缺血模型,脑组织冰冻切片,采用兔抗BDNF(1∶500)抗体,同时运用漂片法和贴片法进行免疫组化ABC法染色。结果漂片法阳性神经元数目和灰度值与贴片法比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。结论脑组织切片免疫组化技术采用漂片法效果更为可靠。

高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型的改良

目的对目前常用的高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建(STZ)建立2型糖尿病大鼠模型的方法进行改良。方法选择40只雄性SD幼鼠,对传统方法进行改良。改良的方法包括:1.采用幼鼠(4周龄)造模;2.用实验方法确定STZ致糖尿病的亚致病剂量;3.大鼠生化指标检测根据用血量不同采取尾静脉、尾动脉和摘除眼球取血等多种取血方式。结果实验组大鼠血糖明显升高(13.7±1.57 mmol/L)。大鼠肝脏、胰腺、脑组织和肾脏等多个器官出现了病变,实验大鼠生存时间较长(9个月以上)。结论本研究完善了2型糖尿病的建模方法。

氯胺酮联用速眠新Ⅱ对食蟹猴麻醉效果观察

目的观察联合应用氯胺酮和速眠新Ⅱ对食蟹猴的麻醉效果。方法采用速眠新Ⅱ（0．1mL／kg）肌内注射和氯胺酮（0．1mL／kg）肌内注射联合麻醉方法对154例实施。肾脏移植手术的食蟹猴进行麻醉，观察动物麻醉维持时间、镇痛效果、呼吸频率和心率变化及术后苏醒情况。结果154例。肾移植食蟹猴无一只在手术过程中因麻醉意外死亡；首次麻醉维持时间为（50～70）min，追加麻醉维持时间为（30～35）min，术后苏醒时间为（25～35）min。麻醉期间肌肉松弛效果好，动物呼吸和心率平稳，手术过程中呼吸频率（40～55）次／min，心率（60—74）次／min。结论氯胺酮联用速眠新Ⅱ复合麻醉对食蟹猴是一种比较理想的麻醉方法，麻醉效果好，术后苏醒快且动物麻醉安全性高。

成功制作离体心脏灌注模型要点和经验

目的探讨并总结制作Langendorff离体心脏灌注模型的要点及成功经验。方法通过16只健康SD大鼠(体质量200～400 g),以HTK液作为心脏停搏液建立标准的Langendorff离体心脏灌注模型,将此模型与持续K-H液心肌灌注、持续心脏搏动组大鼠的同一时段的心肌酶学及血流动力学指标进行对比,使用SPSS 11.5作统计学重复测量资料的方差分析。结果 1例因操作不熟练致提取心脏时间延长,1例因灌注管插入深度过深导致主动脉瓣毁损,1例因室温过低,1例因灌注管管径过大无法插入而导致实验失败,其余12例在应用了室内加热器、不同管径灌注针、自制球囊测压管及加快操作速度后均获得实验成功。所制模型心肌酶学及血流动力学各指标与持续心脏搏动组无明显差异(P>0.05)。结论掌握制作要点及注意事项后,Langendorff离体心脏灌注模型可顺利快速地成功制备。

兔耳缘静脉毛细玻璃管采血法的研究

兔耳缘静脉毛细玻璃管采血法是采用毛细玻璃管在兔耳静缘脉上捻动使血管造成完全开放或不完全开放的小孔。此方法由于损伤刺激小 ,不易产生血管痉挛 ,所以具有出血时间长、出血量大的特点。在 2 3℃以上时 ,5分钟内采血量能够达到 2 0多毫升 ,且能够多次重复采血 ,能够满足多次实验的采血要求。

尾静脉高压注射质粒DNA后体内表达的规律

目的研究小鼠尾静脉高压注射质粒DNA后，目的基因在体内分布表达的规律，以及该方法的转基因效率。方法将LacZ质粒按小鼠体重比稀释到一定的PBS中，经尾静脉快速高压注射导入小鼠体内，通过X-gal染色的方法在不同时间点观察目的基因在肝脏和其他脏器中的分布规律。结果含有CMV启动子的LaeZ裸质粒经小鼠尾静脉高压注射途径导入体内，24h后即开始表达，第3天出现表达高峰，1周后表达消失，基因转染率达5％-6％；用脂质体包裹质粒DNA后，再进行尾静脉高压注射，质粒在肝脏的表达效率可达18％-20％。结论应用尾静脉高压注射脂质体／质粒DNA复合物途径，目的基因在小鼠肝脏获得高效表达，该方法可以广泛应用于基因治疗的实验研究。

生长因子对猪卵母细胞成熟及孤雌胚胎发育的影响

主要探讨了三种生长因子对猪卵母细胞成熟及孤雌胚胎发育及多能基因表达的影响,结果表明:成熟液中添加生长因子后可显著提高卵母细胞成熟率;成熟液和发育液中都添加生长因子后胚胎卵裂率、囊胚率及胚胎质量均显著升高;添加生长因子可极显著提高孤雌囊胚中多能基因的表达.本研究为提高猪卵母细胞成熟及胚胎早期发育奠定了基础,进而为获得更利于分离培养猪胚胎干细胞系的囊胚材料提供了参考.

人工养殖鲶的TRAP遗传分析

建立了鲶Silurus asotus的TRAP-PCR反应体系,采用24个TRAP引物组合对鲶人工选育群体进行引物适用性的研究,将获得的多态性位点用于研究鲶群体的遗传结构。结果表明:有9个引物组合可产生有效位点,其中多态引物占所筛选引物总数的37.5%,平均每条引物扩增出15个位点。共扩增出135个位点,多态位点数为75,多态位点比例为55.56%。说明TRAP标记技术适用于鲶的遗传多样性研究,可以作为构建鲶遗传连锁图谱的分子标记。