猪腹膜间皮细胞的分离培养及初步应用

本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学、免疫学方法鉴定细胞。使用Mhr感染PMC细胞,观察细胞形态变化,并利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法检测细胞活性损伤情况。结果显示,倒置相差显微镜观察显示,分离培养的细胞早期呈拉网状,5~8 d后生长可达融合状态,细胞大小均一,呈多边形铺路石状;间接免疫荧光试验结果显示,细胞波形蛋白、角蛋白-18抗原呈阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原呈阴性;扫描电镜下可见细胞表面微绒毛。结果证实分离培养的细胞为猪PMC细胞,纯度达95%以上。Mhr感染后,光镜下可观察到细胞发生明显皱缩,感染组细胞的LDH释放量较对照组细胞显著升高。本研究成功建立了猪原代PMC细胞的分离培养方法,并初步用于Mhr体外感染,为研究Mhr等引起浆膜炎的病原与宿主的互作机制提供了体外细胞模型。

海绵生物活性物质及海绵细胞离体培养

介绍了来自海绵的生物活性物质种类、分布及其潜在的应用价值。讨论了其作为抗癌、抗病毒、抗细菌等药用的生物活性物质及其相关的海绵种属 ;强调海绵生物活性物质的商业化和临床应用所面临的“供给短缺问题”。作为解决这一问题的途径之一 ,海绵细胞离体培养是最有前景的技术。讨论了海绵细胞离体培养技术的研究现状 ,存在的问题及未来的发展趋势。对我国海域的海绵生物活性物质的研究开发现状进行总结 ,强调海绵研究对开发具有我国自主知识产权的新药、新化合物的必要性及重要性 。

氟在体外对成骨细胞增殖能力及细胞周期的影响

目的 :建立成骨细胞体外培养模型 ,并观察不同浓度的氟对成骨细胞的影响 ,为氟中毒的机制研究提供实验依据。方法 :用幼兔肋骨培养成骨细胞 ,并纯化、鉴定。用不同浓度的氟化钠处理 (2 0 ,16 0 ,2 4 0 ,4 0 0μmol/L)成骨细胞 ,MTT法测定氟对成骨细胞增殖活性的影响 ;流式细胞术测定细胞周期变化及凋亡情况。 结果 :低浓度的氟化钠 (2 0 μmol/L)在体外可显著促进成骨细胞增殖 (P <0 0 1) ,不引起成骨细胞的凋亡 ,可使S期和G2 /M期的细胞明显增多 ;高浓度的氟化钠 (16 0 ,2 4 0 ,4 0 0 μmol/L)则抑制成骨细胞的增殖 (P <0 0 1) ,引起成骨细胞的凋亡 (P <0 0 1和P <0 0 5 ) ,G2 /M期细胞明显减少。结论 :(1)成功建立了氟中毒的体外细胞模型 ;(2 )低浓度的氟化钠可以促进成骨细胞的增殖。高浓度的氟化钠抑制成骨细胞的增殖 ,诱导细胞的凋亡 ,抑制细胞由S期向G2 /M期转化。

共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响

本试验旨在研究共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响。试验分离培养了猪骨骼肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞,2种细胞分离培养鉴定后,接种于Transwell细胞小室共培养板进行共培养,待细胞密度达到90%以上分别进行诱导分化。骨骼肌卫星细胞诱导分化8 d后,检测肌内前体脂肪细胞分化水平、分化标志基因的表达以及脂质代谢关键酶的表达。结果显示:与肌内前体脂肪细胞单独培养相比,共培养体系内肌内前体脂肪细胞的脂滴数量和脂滴面积极显著减少(P<0.01),肌内前体脂肪细胞增殖分化转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ和CCAAT增强子结合蛋白的基因和蛋白表达水平极显著下降(P<0.01),肌内前体脂肪细胞的乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶的基因和蛋白表达水平极显著下降(P<0.01)。由此可见,共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积具有抑制作用。

乳鼠外周神经雪旺氏细胞的体外培养和纯化的研究

本文取５～７天ＳＤ新生大鼠坐骨神经剪碎，用０．２５％胰蛋白酶及０．０３％胶原酶在３７℃消化４５分钟，吹打分散后接种于培养瓶。培养基为含１０％胎牛血清的Ｆ１０。接种后４８小时，加入阿糖胞苷（Ａｒａ－ｃ，Ｓｉｇｍａ）１０－５ｍｏｌ／Ｌ处理，４８小时后换每毫升含神经生长因子（ＮＧＦ）１００μｇ的培养液，刺激雪旺氏细胞（ＳＣ）生长５～７天。此时根据成纤维细胞去除的情况，可再次加入Ａｒａ－Ｃ１～２天或转为无血清培养基一周。这种抗有丝分裂法结合无血清培养法，既能有效去除成纤维细胞，又能减少对ＳＣ的损伤，获得的ＳＣ纯净度可达９８％。

17D黄热病病毒在鸡胚成纤维细胞(DF-1)上的传代培养

比较17D 213-77黄热病病毒株(17D)在不同基质细胞中的培养,观察病毒增殖的情况,探索一种替代目前黄热病疫苗生产的方法。以17D在经典的全鸡胚卵黄囊中传代培养作为对照方法,分别研究其在鸡胚成纤维细胞(DF-1细胞)和Vero细胞上传代培养条件,优化病毒感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)和培养时间;将17D在DF-1细胞上连续传代,观察子代病毒的滴度变化;同时将17D在原代鸡胚细胞(Primary Chicken Embryonic Fibroblasts,CEF)上传代培养。17D在DF-1细胞传代培养最适MOI为0.0001,最佳培养时间为3 d,且连续传代后可以保持稳定的病毒滴度(>8 Lg PFU/m L);17D在Vero细胞传代培养最适MOI为0.01,最佳培养时间为4 d;4种方式传代17D在接种量、培养时间和收获病毒量上有一定区别。DF-1细胞在培养17D上存在一定优势,有成为生产17D黄热病疫苗的基质细胞的可能。

基于混合气体法的H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型建立及优化研究

目的比较移动式三气培养箱和厌氧产气袋密闭培养盒2种混合气体法建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型的优缺点,并进一步对培养条件进行优化。方法将处于对数生长期的H9c2心肌细胞分别置于移动式三气培养箱(94%N2、5%CO2、1%O2)和厌氧产气袋密闭培养盒(21%CO2、5%O2)中,分别缺氧不同时间(2、4、6、8、10 h),再进行复氧(95%O2、5%CO2)4 h。采用MTS法检测心肌细胞存活率,比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性。采用L(934)正交试验进一步对细胞缺氧时间(6、8、10 h)和细胞培养液条件(血清比例、血糖含量)进行优化,最终确定模型建立的最佳缺氧时间和培养条件。结果 2种造模方法均能使心肌细胞存活率下降,乳酸脱氢酶活性升高。但采用移动式三气培养箱造模的心肌细胞存活率在缺氧4 h后能稳步快速下降(6、8、10 h,与正常对照组比较,P<0.01),LDH活性随着缺氧时间的延长明显增高(6、8、10 h,与正常对照组比较,P<0.01),且该模型重复性较好,稳定可控。而厌氧产气袋模型组的细胞存活率及LDH活性均不随时间规律性变化,较难在短时间内建立稳定、可靠的模型。正交试验结果以缺氧6 h、无糖、无血清作为优化培养条件。结论选择移动式三气培养箱法建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型用时短、操作简便,结果相对稳定,将培养液更换为无血清、无糖培养液可加快模型的建立。