微孢子虫分类学研究进展

微孢子虫是一个庞大而广泛存在的微生物群．其中的桑蚕微粒子虫也是桑蚕的主要病原微生物．本报告综述了微孢子虫分类依据的发展过程，着重介绍了微孢子虫门、纲、目、总科、科和属水平的分类学特征，并指出传播、染色体周期和分子生物学的研究进展，对微孢子虫门的分类学研究和昆虫或桑蚕的病理学研究具有重要的意义．

微孢子虫孢子表面蛋白电泳分析及其在种类鉴定上应用的初步研究

对6种(株)昆虫微孢子虫和1种鱼微孢子虫的孢子表面蛋白进行了电泳分析。孢子表面蛋白的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱测定,可重复性高,并具有种的特异性。通过计算多肽带的相对迁移率(Rm),用欧氏距离法计算每种之间的相似系数,用算术平均的不加权对群法进行聚类,得出一种表示种间距离的表型图。两株家蚕微孢子虫的相似系数是0.98,表明它们是同一种,两种玉米螟微孢子虫的相似系数是0.9,作者认为它们是同种。柞蚕微孢子虫与前几种的相似系数是0.73,蝗虫微孢子虫与上述鳞翅目昆虫的微孢子虫的相似系数是0.58;鱼(Glugea anomala)微孢子虫与昆虫的微孢子虫相差甚远,相似系数只有0.25。文中还对将孢子表面蛋白的电泳分析应用于微孢子虫分类鉴定和害虫流行病学的检测进行了讨论。

家蚕微孢子虫研究10年回眸

家蚕微孢子虫研究在近10年取得了突飞猛进的发展,特别是其基因组学分析和侵染相关分子的研究不断推进,为深入开展家蚕微孢子虫功能基因组学研究奠定了基础。通过蛋白质组与功能基因组研究平台,对家蚕微孢子虫孢壁蛋白和分泌蛋白的鉴定以及在微孢子虫侵染中的生物学功能展开了系统的研究;同时,从分子生物学水平详尽研究了家蚕微孢子虫侵染相关分子机制,从蚕业生产实践着手构建家蚕微孢子虫检测防控技术体系,利用现代分子生物学技术探索针对家蚕微孢子虫的家蚕抗性种质材料创建。可以预期,在近10年的研究基础上,未来对家蚕微孢子虫的研究将在侵染与垂直传播机制、分子检测、抗性素材分子育种等方面取得重大突破,并为其它微孢子虫的研究提供信息支持。

家蚕微孢子虫己糖激酶基因的克隆及序列结构分析和原核表达

己糖激酶（hexokinase,HXK）是糖酵解途径的限速酶,在能量代谢中充当极其重要的角色。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）具有完整的糖酵解途径,其基因组中有2个序列相似度较高的己糖激酶编码基因拷贝（NBO_1320g0001,NBO_27g0008）。根据其中的一个基因拷贝（NBO_27g0008）序列设计特异性引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板成功克隆了该基因,命名为Nb HXK-1。该基因大小为894 bp,包含完整的ORF,编码297个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为34.241 k D,等电点（p I）为5.26,蛋白质的氨基酸序列有31个磷酸化位点和4个潜在的N-糖基化位点,无跨膜结构域,有信号肽,二级结构主要由α螺旋（54.55%）、延伸片段（17.80%）和无规则卷曲（27.61%）组成。系统进化分析显示Nb HXK-1与东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）己糖激酶（Nc HXK）氨基酸序列的亲缘关系较近。将Nb HXK-1基因插入原核表达载体p ET-28a（＋）并转化BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达后经蛋白质串联质谱鉴定和Western blot分析显示,获得了与预期大小一致的约35 k D的重组Nb HXK-1蛋白,为进一步阐明Nb HXK-1的生物学功能奠定了基础。

家蚕微孢子虫丙酮酸激酶基因的克隆与表达特征分析

丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)在糖酵解最后一步起着不可逆的作用,可以催化磷酸烯醇式丙酮酸将高能磷酸基团转移给ADP生成ATP和丙酮酸。通过在NCBI和家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)数据库中对丙酮酸激酶基因的比对分析,选择家蚕微孢子虫丙酮酸激酶M2亚型的一个基因(NbPK-2,GenBank登录号EOB11679.1)进行克隆。生物信息学分析显示,该基因序列长度为1 359 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码452个氨基酸,预测蛋白质等电点为7.13,相对分子质量为51.7 kD,没有信号肽;NbPK-2蛋白的二级结构预测显示其含有38%的螺旋、21%的延伸片段和40%无规则卷曲。通过qRT-PCR检测感染微孢子虫后家蚕不同发育时期的NbPK-2表达水平,发现该基因在感染后24 h内处于相对较高的表达水平,而此后表达水平开始降低,至144 h达到最低值,在168 h又有所升高。研究结果可促进对家蚕微孢子虫糖酵解途径的研究,为家蚕微粒子病的防控奠定理论基础。

感染家蚕微孢子虫的蚕体血淋巴蛋白质差异表达分析及质谱鉴定

昆虫具有高效的先天性免疫系统,血淋巴在免疫过程中发挥重要作用。收集感染家蚕微孢子虫(Nb)后第2、4、6、8天的家蚕幼虫血淋巴,分别以相同发育时期健康家蚕幼虫的血淋巴为对照,进行蛋白质SDS-PAGE电泳分析,寻找家蚕免疫应答Nb侵染的相关蛋白质。结果显示,从感染Nb第6天起,幼虫血淋巴蛋白质组成发生改变,感染第8天的血淋巴样品中出现了3条明显下调的差异蛋白条带。利用线性离子阱质谱技术(Linear Ion Trap Quadrupole,LTQ)鉴定差异蛋白条带,主要有肌动蛋白3(Actin 3)、载脂蛋白(apolipophorin protein)、性别特异储存蛋白2(sex-specific storage-protein 2 precursor)、储藏蛋白(storage protein)、酚氧化物酶亚基(phenoloxidase subunit)、转铁蛋白(transferrin)和热激相关蛋白70(heat shock cognate protein70),这7种蛋白质分别在家蚕的能量代谢、先天性免疫以及蛋白质合成、运输、修复等方面扮演重要角色。家蚕感染Nb后血淋巴中的上述7种蛋白质的表达变化,推测可能会影响蚕体自身对Nb的免疫防卫反应能力。

榆绿毛萤叶甲寄生微粒子虫新种记述(微孢子门:微粒子科)

本文记述寄生于榆绿毛萤叶甲的一种微粒子虫新种的光镜和电镜形态特征及寄生习性，并讨论了新种鉴别特征。

从野外昆虫体内分离的5株微孢子虫的生物学特性与分子系统发育研究

从广西蚕区的野外昆虫菜粉蝶(Pieris rapae)、桑尺蠖(Hemerophila atrilineata)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)的体内收集到5株对家蚕有一定食下感染力的微孢子虫,通过生物学性状、分子系统发育研究,为其分类鉴定提供依据。来自野外昆虫的5株微孢子虫均具有Nosema属的生物学特性:显微镜下观察形状均呈长卵圆形,与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)有较明显差异;在生活史的各发育阶段均为双核,以二分裂方式增殖,最后形成双核成熟孢子;与Nb抗血清均产生阳性凝聚反应;超微结构观察均具双核,极丝圈数在12～14圈之间,极丝倾斜角与Nb有差异。根据5株野外昆虫微孢子虫与其它昆虫微孢子虫基于SSU rRNA基因序列构建的系统发育树,以及基于SSU rRNA和rRNA ITS基因序列进行的相似性和遗传距离分析,初步认为5株野外昆虫微孢子虫与家蚕微孢子虫同属异种。

微孢子虫检测方法研究进展

微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,是虾、蟹、蜜蜂和家蚕等经济动物的寄生虫之一,对生命活动和经济价值危害较大。有些微孢子虫甚至会感染人类,引起患者剧烈腹泻,甚至死亡。建立快速、简便、高效的早期诊断方法成为当前微孢子虫检测领域中的研究热点。本文从镜检染色、分子生物学和免疫学方面总结了微孢子虫的检测与鉴定方法,包括KMnO4-甲基紫法、甘油凝胶湿片法、环介导等温PCR扩增技术、条件优化的ELISA、免疫学快速检测试纸条等,为微孢子虫检测方法开发及微孢子虫防治提供系统的参考资料。

利用荧光定量PCR检测方法对柞蚕不同生产阶段柞蚕微孢子虫发生情况的初步调查

柞蚕微粒子病是柞蚕生产中重点检测的病害,目前主要采用镜检淘汰带毒母蛾及子代卵的方法进行病害防控,而荧光定量PCR检测方法具有较高的灵敏度,能够有效提高柞蚕生产中对微孢子虫的阳性检出率。应用荧光定量PCR检测方法对来自2个蚕区柞蚕蛹、蛾的微孢子虫发生情况进行初步调查,同时考察蛹期不同积温发育时期微孢子虫的发生情况以及蛾期亲本带毒对子代卵带毒的影响。结果表明,在蛹期积温中后期(150℃以后)柞蚕微孢子虫的阳性检出率提高,可以考虑在这一发育阶段利用荧光定量PCR方法进行蛹期提前预检;在检验柞蚕微孢子虫垂直传播过程中,发现亲本蛾带毒情况对子代卵带毒存在不同程度的影响,有必要用荧光定量PCR检测方法在卵期对柞蚕微孢子虫进行辅助检测,可以弥补常规蛾期检测的漏检问题。研究结果为应用荧光定量PCR检测技术,在蛹期提前预检以提高种茧品质,在蛾期检测以及卵期辅助检测以减少柞蚕微孢子虫的垂直传播,最终有效控制柞蚕微粒子病的发生提供了参考依据。

一株家蚕病原性微孢子虫的生物学特性与分子系统发育分析

从家蚕体内分离得到一株新的病原性微孢子虫,编号为GXM1。光学显微镜下观察GXM1微孢子虫为长卵圆形,大小(1.85±0.15)μm×(4.19±0.18)μm,在生活史的各发育阶段均为双核,以二分裂方式增殖,发育速度缓慢,发育周期约8～10 d。GXM1微孢子虫与家蚕微孢子虫(Nb)的抗血清产生阳性凝聚反应。利用透射电子显微镜观察到GXM1微孢子虫的超微结构具双核,极丝11～12圈,极丝倾斜角约45°。以上生物学性状显示GXM1微孢子虫具有微孢子虫属(Nosema)的基本分类特征。依据GXM1微孢子虫与其它昆虫微孢子虫的SSU rRNA基因序列构建的系统发育树,以及序列相似性和遗传距离分析,进一步证实GXM1微孢子虫属于Nosema属。GXM1微孢子虫对蚁蚕的半数感染浓度(IC50)为6.06×105mL-1,对家蚕的胚种传染率可达23.28%,是一株具有较强致病性和危害性的家蚕病原性微孢子虫。

柞蚕微孢子虫对不同昆虫细胞的感染特性分析

为建立柞蚕微孢子虫体外培养增殖方法,找到适合微孢子虫增殖的昆虫细胞,将柞蚕微孢子虫接种High5、Sf21和柞蚕卵巢原代细胞后进行显微观察,分析不同昆虫细胞对柞蚕微孢子虫的敏感性。结果发现,柞蚕微孢子虫可以通过吞噬或胞饮作用进入High5和Sf21细胞中,但在这2种细胞的整个病变过程中,均未观察到孢子增殖阶段的其他形态;柞蚕微孢子虫接种柞蚕卵巢原代细胞后,在细胞病变过程中可以观察到裂殖体、产孢体、孢子母细胞等增殖阶段的孢子形态,后期扩繁的孢子大量形成并释放。结果表明,柞蚕微孢子虫在High5、Sf21这2种细胞中不能扩繁增殖,但可以侵染柞蚕卵巢原代细胞,并大量增殖扩繁。

柞蚕微孢子虫长极丝型孢子总蛋白的鉴定及功能分析

柞蚕(Antheraea pernyi Guerin-Meneville)是中国北方重要的吐丝经济昆虫,柞蚕微孢子虫(Nosema antheraeae)引起的柞蚕微粒子病是柞蚕产业毁灭性的病害。本研究采用梯度Percoll-NaCl溶液分离纯化柞蚕微孢子虫,提取柞蚕微孢子虫总蛋白,胰蛋白酶消化,然后通过LC-MS/MS精确获得各肽段分子量,经数据库比对后共鉴定到610个蛋白。对鉴定到的蛋白质进行GO蛋白质功能分析,发现孢子时期参与大分子复合物及结构分子活性的蛋白的较多,而参与细胞催化和绑定功能、细胞过程及代谢过程的表达蛋白的所占的比例明显低于预测基因的的比例。研究认为这一结果主要与孢子期的微孢子虫脱离宿主细胞,生理不活跃,处于相对静止的时期,没有能量和物质来源有关;微孢子虫通过降低细胞活动和物质代谢,从而适应所处的环境。

从梨花迁粉蝶中所得微孢子虫的系统进化分析

从中国云南省野外采集的梨花迁粉蝶(Catopsilia pyranthe)中分离得到一株疑似微孢子虫,对该分离株的核糖体SSUrRNA(Small subunit ribosomal RNA)和α-tubulin基因进行克隆测序。通过序列分析及系统进化树构建,结果发现该分离株属于Nosema属的一种微孢子虫,命名为Nosema sp.CP。通过对SSUrRNA系统进化分析发现,Nosema sp.CP与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、斜纹夜蛾微孢子虫(Nosema spodopterae)的亲缘关系相对于菜粉蝶微孢子虫Nosema sp.MPr更加接近。通过对α-tubulin基因的系统进化分析,结果表明Nosema sp.CP与N.bombycis聚在一支上,进一步证实了它们的紧密关系。因此,本研究首次在粉蝶科(Pieridae)的梨花迁粉蝶中分离得到的Nosema属微孢子虫是与家蚕微孢子虫非常近源的一类微孢子虫,并暗示了粉蝶科昆虫感染的微孢子虫具有潜在多样性。