MiR-338-3p通过靶向WNK1影响食管癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的机制研究

目的探讨miR-338-3p影响食管癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的分子机制及其对WNK1的靶向调控作用。方法体外培养人正常食管上皮细胞株Het-1A与人食管癌细胞Eca-109、EC-1、EC9706,采用q RT-PCR与Western blot分别检测miR-338-3p、WNK1的表达水平;以EC9706细胞为研究对象,分别将miR-con、miR-338-3p mimics、si-con、si-WNK1、miR-338-3p mimics与pc DNA、miR-338-3p mimics与pc DNA-WNK1转染至EC9706细胞;MTT法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡、Transwell小室实验检测迁移及侵袭能力;双荧光素酶报告实验检测miR-338-3p与WNK1的靶向关系。结果与Het-1A比较,食管癌细胞Eca-109、EC-1、EC9706中miR-338-3p的表达显著下调(P<0.05),WNK1 m RNA及蛋白表达显著上调(P<0.05);转染miR-338-3p mimics或si-WNK1可明显降低EC9706细胞的活力、迁移及侵袭细胞数(P<0.05),增加EC9706细胞的凋亡率(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-338-3靶向结合WNK1;共转染miR-338-3p mimics与pc DNA-WNK1可明显逆转转染miR-338-3p mimics对细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的作用。结论miR-338-3p可靶向下调食管癌中的WNK1,进而抑制食管癌细胞的增殖、迁移及侵袭,和诱导细胞凋亡。

miR-335-5P调控的TGF-β通路介导妊娠糖尿病小鼠胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌的实验研究

目的使用miR-335-5P和转化因子-β(TGF-β)处理妊娠期糖尿病(GDM)小鼠,明确miR-335-5P调控TGF-β通路参与促进胰岛β细胞分泌和增强胰岛素抵抗机制,为治疗GDM患者开辟新道路。方法SPF级Balb/c小鼠以雌性和雄性小鼠2∶1合笼饲养,10只正常妊娠小鼠作为空白组,48只成功构建GDM模型的小鼠作为GDM组并随机分成A、B、C、D、E、F组,每组各8只小鼠。A组(模型组)、B组(模型组+溶媒)、C组(模型组+miR-335-5P模拟物)、D组(模型组+miR-335-5P抑制剂)、E组(模型组+si-TGF-β)、F组(模型组+miR-335-5P抑制剂+si-TGF-β)。药物处理后行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)检测空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FIRI),计算稳态模型胰岛素抵抗指数(IRI);进行高血糖钳夹试验测定葡萄糖输注速率(GIR),估计胰岛β细胞功能;采用RT-qPCR、蛋白质印迹分析和ELISA胰岛素释放测定胰岛β细胞中miR-335-5P、TGF-β通路关键因子mRNA水平。结果D、F组FBG、FIRI、IRI低于给药前低于C、E组(P<0.05);D、F组GIR、第一时相胰岛素、最大胰岛素高于给药前高于C、E组(P<0.05);D、F组miR-335-5P、TGF-β、c-Myc表达低于C、E组低于A、B组(P<0.05);在胰岛β细胞中检测到miR-335-5P表达时,TGF-β、c-Myc均有不同程度的表达;TGF-β在胰岛β细胞胞质内表达,且D、F组TGF-β表达高于C、E组高于A、B组(P<0.05)。结论miR-335-5P可上调GDM小鼠c-Myc表达,进一步激活TGF-β通路,增强胰岛素抵抗并抑制胰岛β细胞分泌。

沉默miR-331-5p对帕金森病模型大鼠的干预效果及作用机制

目的探究沉默miR-331-5p对帕金森病模型大鼠的干预效果及相关作用机制。方法选取40只SD健康雄性大鼠,10只为正常组,其余30只建立帕金森病模型,随机分为模型组、上调组、沉默组,4组大鼠分别干预。检测各组学习记忆能力,观察各组脑组织苏木素-伊红(HE)染色,统计神经元大小,RT-PCR检测miR-331-5p表达,酶联免疫吸附试验检测白细胞介素(IL)-3、肿瘤坏死因子(TNF)-α、过氧化氢酶(CAT)、终末氯化蛋白(AOPP)水平,Western印迹检测苏氨酸蛋白磷酸酶(PHLPP)1、重组人自噬效应蛋白(Beclin)-1、微管相关蛋白轻链(LC)3-Ⅱ、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、雷帕霉素机械靶蛋白(mTOR)相对表达量。结果与正常组比较,其他3组miR-331-5p、PHLPP1表达较高,逃避潜伏期较长,穿越平台次数较低,两侧神经元较小,CAT水平较低,IL-3、TNF-α、AOPP水平较高,Beclin-1、LC3-Ⅱ相对表达量较高,PI3K、mTOR相对表达量较低(P<0.05)。与模型组、上调组比较,沉默组miR-331-5p、PHLPP1表达较低,逃避潜伏期较短,穿越平台次数较高,两侧神经元较大,CAT水平较高,IL-3、TNF-α、AOPP水平较低,Beclin-1、LC3-Ⅱ相对表达量较低,PI3K、mTOR相对表达量较高(P<0.05)。结论沉默帕金森病大鼠miR-331-5p表达,对学习能力及记忆能力均可造成极大提升,对于脑组织神经元大小的改善效果也较为显著,能够显著缓解脑组织内的炎症状态及氧化应激反应,能够有效抑制脑组织细胞的自噬、凋亡,从而起到神经元保护作用。

OSTN-AS1/miR-330调控前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制

目的探讨OSTN的反义RNA 1(OSTN-AS1)对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法收集25例前列腺癌患者的癌组织和对应癌旁组织RT-qPCR检测组织中OSTN-AS1和miR-330的表达。体外培养前列腺癌PC-3M细胞,分别转染OSTN-AS1小干扰RNA、miR-330抑制剂或共转染OSTN-AS1小干扰RNA与miR-330抑制剂。流式细胞仪检测细胞周期,克隆形成实验检测细胞克隆形成数,Transwell检测细胞迁移和侵袭,RT-qPCR检测miR-330和MMP-2的mRNA表达。双荧光素酶报告基因实验验证OSTN-AS1与miR-330及miR-330与MMP-2调控关系。将转染后的PC-3M细胞接种至裸鼠皮下,饲养4周后,剥离肿瘤并称重。结果前列腺癌组织中OSTN-AS1表达升高(P<0.05),而miR-330表达降低(P<0.05)。下调OSTN-AS1可阻滞体外PC-3M细胞的细胞周期进程,抑制细胞增殖、迁移和侵袭,同时抑制体内肿瘤生长。下调miR-330促进体外PC-3M细胞的细胞周期进程及增殖、迁移和侵袭能力,同时促进体内肿瘤生长。OSTN-AS1负调控miR-330表达,miR-330负调控MMP-2表达。下调OSTN-AS1对体外PC-3M细胞的细胞周期、增殖、迁移和侵袭的抑制作用及体内肿瘤生长抑制作用可被下调miR-330逆转。结论 OSTN-AS1可能通过调控miR-330/MMP-2轴促进前列腺癌发展进程,其可能成为前列腺癌治疗的分子靶点。

外泌体miR-338对骨质疏松大鼠骨代谢水平、骨小梁微结构和骨生物力学的影响

目的:探讨外泌体miR-338对骨质疏松大鼠骨代谢水平、骨小梁微结构和骨生物力的影响。方法:采用健康成年SPF级SD雄性大鼠进行骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离。采用双侧卵巢摘除手术方法构建了骨质疏松大鼠模型。采用qRT-PCR法检测miR-338的表达水平;检测大鼠的骨密度,骨小梁微结构和骨生物力学指标。结果:与空白对照组相比,OP模型组、OP+ExoBMSCs、抑制组和过表达组miR-338的表达水平明显更高(P<0.05);抑制组的miR-338的表达水平低于OP模型组、OP+ExoBMSCs和过表达组(P<0.05);与空白对照组相比,OP模型组、OP+ExoBMSCs、抑制组和过表达组OC、PINP、BALP的表达水平明显更低(P<0.05);抑制组的OC、PINP、BALP的表达水平明显高于OP模型组、OP+ExoBMSCs和过表达组(P<0.05);与空白对照组相比,OP模型组、OP+ExoBMSCs、抑制组和过表达组BV/TV、Th.N、Tb.Th、Conn.D水平更低,而Tb.Sp、SMI明显更高(P<0.05);抑制组组的BV/TV、Th.N、Tb.Th、Conn.D水平明显高于OP模型组、OP+ExoBMSCs和过表达组,而Tb.Sp、SMI更低(P<0.05);与空白对照组相比,OP模型组、OP+ExoBMSCs、抑制组和过表达组BMD、最大荷载、最大应力、最大位移、刚度水平更低(P<0.05);抑制组的BMD、最大荷载、最大应力、最大位移、刚度水平高于OP模型组、OP+ExoBMSCs和过表达组(P<0.05)。结论:BMSCs源性的miR-338可影响骨质疏松大鼠骨代谢、骨小梁微结构和骨生物力学状态。

下调lncRNA MCF2L-AS1靶向miR-33b-5p抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭并促进凋亡

目的:探讨lncRNA MCF2L-AS1对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及分子机制。方法:选取45例胃癌患者的癌组织及癌旁正常组织,或培养胃黏膜上皮细胞GES-1、胃癌细胞HGC-27,采用RT-qPCR检测MCF2L-AS1和mi R-33b-5p的表达水平。采用双荧光素酶报告实验检测MCF2L-AS1和mi R-33b-5p的靶向关系。将HGC-27细胞分为si-NC组、si-MCF2L-AS1组、mimic NC组、mi R-33b-5p mimic组、si-MCF2L-AS1+inhibitor NC组、si-MCF2L-AS1+miR-33b-5p inhibitor组,分别转染si-NC、si-MCF2L-AS1、mimic NC、mi R-33b-5p mimic或共转染si-MCF2L-AS1+inhibitor NC、si-MCF2L-AS1+miR-33b-5p inhibitor。采用MTT实验检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,克隆形成实验检测细胞克隆形成数,Transwell实验检测迁移和侵袭细胞数。结果:与癌旁正常组织或GES-1细胞相比,胃癌组织或HGC-27细胞中MCF2L-AS1表达水平升高、mi R-33b-5p表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。MCF2L-AS1可靶向调控mi R-33b-5p。下调MCF2L-AS1或过表达mi R-33b-5p,mi R-33b-5p表达水平升高,HGC-27细胞凋亡率升高,但细胞增殖、克隆形成数、迁移和侵袭数均减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。抑制mi R-33b-5p可减弱下调MCF2L-AS1对HGC-27细胞的生物学作用。结论:下调MCF2L-AS1通过上调mi R-33b-5p抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭并促进凋亡;MCF2L-AS1通过靶向调控mi R-33b-5p表达进而参与胃癌细胞的恶性生物学行为。

清肾颗粒对大鼠NRK-52E细胞转分化模型miR-23b和PINK1/Parkin通路的影响

目的 探讨TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型中miR-23b对PINK1/Parkin通路的靶向调节机制,并阐明清肾颗粒含药血清对NRK-52E细胞转分化的干预机理。方法 采用超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱法对清肾颗粒进行全指纹图谱分析。构建TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型,转染siRNA后分为模拟物空载对照组、miR-23b-5p模拟物组、抑制剂空载对照组、miR-23b-5p抑制剂组,观察miR-23b-5p对PINK1表达量的影响。再将NRK-52E细胞分组为正常组、TGF-β1组、清肾颗粒组、miR-23b-mimic-NC组、miR-23b-mimic组、miR-23b-mimic+清肾颗粒组,Western blot法检测NRK-52E细胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表达,RT-qPCR法检测NRK-52E细胞中miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-23b-5p与PINK1的靶向关系。结果 UPLC指纹图谱法鉴定出清肾颗粒中11个活性成分。miR-23b-5p过表达后,PINK1 mRNA表达量也显著增加(P<0.05);而miR-23b-5p表达沉默后,PINK1 mRNA表达量也显著减少(P<0.05)。双荧光素酶报告显示,Rno-miR-23b-5p能显著下调Rno-PINK1-WT荧光素酶活性(P<0.05),但未能下调突变Rno-PINK1-mut荧光素酶活性(P>0.05)。清肾颗粒含药血清干预实验发现,TGF-β1组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显低于正常组,P62和α-SMA表达明显高于正常组(P<0.05)。清肾颗粒组和miR-23b-mimic组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显高于TGF-β1组,P62和α-SMA表达明显低于TGF-β1组(P<0.05)。miR-23b-mimic+清肾颗粒组的表现更优于miR-23b-mimic组(P<0.05)。结论 清肾颗粒能够上调NRK-52E细胞内miR-23b-5p表达,并通过增强PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬活性,抑制NRK-52E细胞转分化进程。

强直性脊柱炎模型小鼠踝关节组织和临床患者PBMC中miR-142-5p,SOCS1 mRNA表达及与免疫功能分析研究

目的探究强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)模型小鼠和临床患者外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cell,PBMC)中微小RNA-142-5p(miR-142-5p),细胞因子信号转导抑制因子1(suppressor ofcytokine signaling 1,SOCS1)mRNA表达及其对免疫功能的影响。方法通过实时荧光定量(quantitative real timePCR,qRT-PCR)检测2022年1月~2023年3月商丘市第一人民医院收治的30例确诊的AS患者(患者组)和30例健康体检者(健康组)的PBMC中miR-142-5p和SOCS1 mRNA水平。采用牛蛋白聚糖联合完全弗氏佐剂诱导AS小鼠模型,然后将小鼠分为对照组、模型组、阴性组和拮抗剂组。对照组和模型组小鼠尾静脉注射生理盐水,阴性组和拮抗剂组小鼠分别尾静脉注射NC-antagomir和miR-142-5p-antagomir。治疗2周后,分别评估各组小鼠的关节炎症状评分。通过苏木精伊红(hematoxylin eosin,HE)染色评价踝关节形态。采用ELISA法检测小鼠血清中Th1细胞因子干扰素γ(IFN-γ)、Th2细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、Th17细胞因子白细胞介素-17(IL-17)和Treg细胞因子叉头盒蛋白P3(FOXP3)的表达水平。通过qRT-PCR和Western blot检测PBMC和踝关节组织中miR-142-5p,SOCS1,IFN-γ,IL-4,IL-17和FOXP3的mRNA和蛋白表达水平。结果与健康组比较,患者组PBMC中miR-142-5p水平升高(3.03±0.99 vs1.00±0.21),SOCS1 mRNA水平降低(0.41±0.09 vs 1.00±0.18),差异具有统计学意义(t=10.997,15.956,均P<0.001)。与对照组比较,模型组小鼠踝关节组织中miR-142-5p水平(4.00±0.52 vs 1.00±0.04)升高,IFN-γ和IL-17的mRNA和蛋白水平均升高,SOCS1,IL-4和FOXP3的mRNA和蛋白水平均降低,差异具有统计学意义(t=23.356,31.420,48.056,47.224,38.035,29.007,54.183,28.123,55.155,26.758,45.346,均P<0.05);关节炎症状评分升高(7.83±0.94 vs 0.00±0.00,t=22.212,P<0.05),踝关节结构破坏明显;血清中IFN-γ,IL-17水平以及IFN-γ/IL-4比值(0.81±0.08 vs 2.08±0.33)和IL-17/FOXP3比值(0.41±0.03 vs 1.27±0.10)均升高,差异具有统计学意义(t=15.382,35.779,15.412,35.130,均P<0.05)。与阴性组比较,拮抗剂组小鼠踝关节组织中miR-142-5p水平(1.47±0.10 vs 3.89±0.33)降低,IFN-γ和IL-17的mRNA和蛋白水平均降低,SOCS1,IL-4和FOXP3的mRNA和蛋白水平均升高,差异具有统计学意义(t=18.846,22.969,43.454,32.617,23.259,20.881,41.832,11.994,32.977,15.190,35.834,均P<0.05);关节炎症状评分降低(7.42±1.24 vs 2.75±0.75,t=13.233,P<0.05),踝关节形态明显改善;血清中IFN-γ,IL-17水平以及IFN-γ/IL-4比值(1.22±0.11 vs 1.91±0.19)和IL-17/FOXP3比值(0.69±0.05vs 1.23±0.12)均降低,差异具有统计学意义(t=8.688,22.972,8.377,22.007,均P<0.05)。结论miR-142-5p在AS中高表达,使用拮抗剂下调miR-142-5p可能通过上调SOCS1进而降低Th1/Th2和Th17/Treg比值,从而改善AS小鼠的免疫平衡并抑制AS的进展。

miR-379-5p抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖、侵袭和迁移

目的 通过研究miR-379-5p对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖、侵袭和迁移的影响,为临床抑制乳腺癌增殖、侵袭和转移提供新的治疗靶点。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测miR-379-5p在质粒转染后4T1细胞中的表达情况;采用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine, EdU)细胞增殖实验与Transwell实验检测各组4T1细胞增殖能力与侵袭能力;然后通过伤口愈合实验来检测过表达以及敲低miR-379-5p对4T1细胞迁移能力的影响;利用BABL/c小鼠建立乳腺癌小鼠移植瘤模型,观察miR-379-5p过表达后对体内肿瘤生长状况,肺转移灶数量及大小的影响。结果 EdU结果显示,与对照组相比,敲低miR-379-5p能增强乳腺癌细胞的增殖能力,过表达miR-379-5p能够抑制乳腺癌细胞的增殖能力(P<0.05);Transwell与伤口愈合实验结果显示,敲低miR-379-5p能够增强乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力,过表达miR-379-5p显著抑制细胞的侵袭和迁移能力(P<0.01)。BABL/c小鼠体内成瘤实验显示,过表达miR-379-5p可显著减缓肿瘤的生长速度(P<0.05),对肺转移有抑制作用(P<0.01)。结论 miR-379-5p在乳腺癌中起到抑癌基因的作用,抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖、侵袭和迁移。

过表达miR-181a-5p的口腔癌皮下移植瘤小鼠模型的小肠代谢组学研究

目的通过检测口腔癌皮下移植瘤小鼠小肠中代谢物和代谢通路的变化,分析过表达miR-181a-5p对皮下移植瘤小鼠小肠中代谢物和代谢物组的影响。方法实验分为3组,空白对照(Control)组、阴性对照(negative control,NC)组以及实验(over expression of miR-181a-5p,OE)组。将不同组别处理后的细胞混悬液,通过皮下注射到M-NSG重度免疫缺陷雌性小鼠右侧腹股沟中上部,构建成口腔癌皮下移植瘤小鼠模型。按时记录小鼠体重变化,对小鼠小肠组织进行HE染色,观察各组病理变化。采用超高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用仪和串联Orbitrap质谱联用仪检测NC组、OE组和Control组小鼠小肠中的代谢物,使用XCMS预分析原始数据,质量评价样本数据,鉴定Control组与NC组、NC组与OE组的差异代谢物,进行KEGG富集分析获取差异代谢通路。结果Control组和NC组小肠组织中共鉴定出170种差异代谢物。代谢物富集的显著性信号通路包括胆碱代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、γ-氨基丁酸(GABA)神经突触代谢、甘油磷脂代谢、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路代谢、癌症中心碳代谢以及烟酸和烟碱胺代谢通路。NC组和OE组相比,小鼠小肠中检测到VIP(variable importance in the projection)>2的差异代谢物有16种,显著性差异代谢物包括甘油磷酰胆碱、棕榈酸、3-羟基丁酰肉碱、β-羟丁酸等。代谢物富集到的显著性差异通路为胆碱代谢通路。结论口腔癌皮下移植瘤可引起小鼠小肠的代谢物发生变化,主要改变了小肠中与能量代谢相关的代谢物。过表达miR-181a-5p影响口腔癌皮下移植瘤小鼠小肠代谢物,代谢物富集通路为胆碱代谢通路。

miR-433-3p通过调控MAPK8蛋白在H_(2)O_(2)诱导的心肌细胞损伤中发挥保护作用

目的探究miR-433-3p在过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的大鼠心肌细胞(H9c2)损伤中的作用及具体机制的研究。方法构建氧化应激损伤模型,以H9c2心肌细胞为研究对象,通过转染miR-433-3p模拟物(miR-433-3p mimics)、miRNA阴性对照(miR-NC)、阴性对照(pcDNA-NC)和MAPK8过表达质粒(pcDNA-MAPK8)至H_(2)O_(2)诱导的H9c2细胞中,将细胞分为对照组(Control),H_(2)O_(2)模型组(H_(2)O_(2)),H_(2)O_(2)+miRNA阴性对照组(H_(2)O_(2)+miR-NC),H_(2)O_(2)+miR-433-3p模拟物组(H_(2)O_(2)+miR-433-3p mimics),H_(2)O_(2)+miR-433-3p模拟物+pcDNA阴性对照组(H_(2)O_(2)+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC)和H_(2)O_(2)+miR-433-3p模拟物+MAPK8过表达组(H_(2)O_(2)+miR-433-3p mimics+pcDNA-MAPK8)。采用qRT-PCR法检测miR-433-3p和MAPK8在H9c2细胞中的mRNA表达水平。MTT法和ELISA试剂盒分别检测细胞活性和乳酸脱氢酶(LDH)释放量。Western blot法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、MAPK8和GAPDH的蛋白表达水平。双荧光素酶报告实验检测miR-433-3p与MAPK8之间的靶向关系。结果与对照组相比,miR-433-3p在H_(2)O_(2)诱导的心肌细胞H9c2中低表达。相比较H_(2)O_(2)+miR-NC组,miR-433-3p过表达可以显著降低LDH释放量并增强细胞活力。此外,相比较H_(2)O_(2)+miR-NC组,miR-433-3p过表达可以显著降低促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3的表达水平,而促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。双荧光素酶报告实验显示miR-433-3p可以靶向结合MAPK8并负调控MAPK8的表达。过表达MAPK8可逆转miR-433-3p过表达对H_(2)O_(2)诱导的H9c2细胞活性损伤和细胞凋亡的抑制作用。结论miR-433-3p通过负靶向调控MAPK8在H_(2)O_(2)诱导的心肌细胞损伤中发挥保护作用。

Orexin-A和RJR-2403影响脊髓腹角神经元自发动作电位的比较

目的:探究食欲素-A(orexin-A)和α_(4)β_(2)-N型乙酰胆碱受体(α_(4)β_(2)-nAChR)选择性激动剂RJR-2403分别对新生大鼠离体脊髓腹角神经元自发动作电位影响的差异。方法:应用8~12 d新生SD大鼠,麻醉后游离出颈端至骶部的脊髓,保留腰骶膨大节段并制备切片。切片孵育30min,采用木瓜蛋白酶消化19~22 min,转常温孵育45~60 min。沿中央管切取脊髓腹角,使用口径从大到小的巴斯德吸管急性机械分离神经元,静置20 min待细胞贴壁,在倒置显微镜下利用膜片钳记录良好的神经元,联合药理学方法进行功能性研究。在电流钳记录模式下,观察orexin-A和RJR-2403分别对离体脊髓腹角神经元自发放电(动作电位)的影响,并比较多种参数的差异。结果:(1)本研究应用急性分离的脊髓腹角神经元进行膜片钳记录,所记录的神经元胞体完整,形态多样,能发出较多突起且有分支;(2)给予orexin-A前的腹角神经元自发动作电位的频率[(3.55±0.66)Hz]低于给药后[(8.26±3.31)Hz](P<0.01),给药前动作电位幅值[(95.28±7.21)mV]高于给药后[(85.15±5.80)mV](P<0.05),静息电位和动作电位半幅时程无明显变化;(3)应用RJR-2403前,腹角神经元的静息电位[(-66.67±43.38)mV]高于给药后[(-60.48±3.38)mV](P<0.01),给药前放电频率[(2.74±1.60)Hz]低于给药后[(8.94±3.14)Hz](P<0.001),给药前动作电位幅值[(84.96±4.85)mV]高于给药后[(73.77±5.42)mV](P<0.01),给药前半幅时程[(4.34±1.52)ms]低于给药后[(5.39±1.80)ms](P<0.01)。结论:Orexin-A和RJR-2403对脊髓腹角神经元自发动作电位均具有正性调制作用,但对于静息电位、半幅时程存在不同作用,可能源于促代谢型受体和促离子型受体介导的作用差异。

miR-10b通过激活KLF4/Notch-1/STAT3信号途径加速腹主动脉瘤的进展

目的:miR-10b促进动脉瘤的进展但其机制未明确,本实验通过检测miR-10b对KLF4/Notch-1/STAT3途径的影响阐明其机理。方法:双荧光素酶实验验证miR-10b的靶基因。取20只apoE-/-小鼠构建腹主动脉瘤模型,其中10只尾静脉注射miR-10b过表达的慢病毒,分别记为模型组和miR-10b组。另取10只apoE-/-小鼠作为假手术组,28 d后解剖小鼠腹主动脉行病理学染色、Western-blot实验。将血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用后的THP-1巨噬细胞根据是否转染miR-10b mimic及其Nc对照、是否添加抑制剂分组:(1)Nc组;(2)miR-10b mimic组;(3)Nc+KLF4抑制组;(4)miR-10b mimic+KLF4抑制组;(5)Nc+Notch-1抑制组;(6)miR-10b mimic+Notch-1抑制组;(7)Nc+STAT3抑制组;(8)miR-10b mimic+STAT3抑制组,检测细胞内蛋白水平。结果:检测双荧光素酶活性得知miR-10b可靶向作用于基因KLF4。小鼠血管病理实验发现,与正常小鼠相比,动脉瘤模型小鼠的血管明显增粗、组织结构异常,miR-10b可加重血管病变;CD68+巨噬细胞、蛋白Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9在假手术组、模型组与miR-10b逐渐增多,而α-SMA、蛋白KLF4逐渐减少。(1)、(2)两组细胞间,后者KLF4表达较少、而Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9表达显著偏多;KLF4抑制剂抑制KLF4表达,而Notch-1显著增多;Notch-1被抑制而减少表达,p-STAT3也随之减少;p-STAT3被抑制表达,MMP-2与MMP-9表达量也明显降低。结论:miR-10b通过作用于KLF4/Notch-1/STAT3信号途径,引起动脉瘤组织中MMP-2、MMP-9表达增加,从而加速动脉瘤的进程。

基于PPARγ/LXR-α信号通路探讨槲皮素对急性肺损伤肺泡巨噬细胞胞葬功能影响机制

目的 观察槲皮素对急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能的影响,并基于过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)/肝X受体α(LXR-α)信号通路研究其作用机制。方法 将60只雄性SD大鼠随机分为6组,每组10只。槲皮素低、中、高剂量组分别于造模前给予10 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的槲皮素灌胃,地塞米松组给予5 mg/kg的地塞米松灌胃,正常组和脂多糖组给予等量生理盐水灌胃,均1次/d。连续灌胃14 d后,除正常组外,其余组均采用鼻滴法给予脂多糖建立急性肺损伤模型。于造模后24 h,检测各组大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能,原位末端转移酶标记法(TUNEL)测定肺组织细胞凋亡率,ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)水平,HE染色观察肺组织病理形态,免疫组化法检测肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68蛋白阳性表达情况,RT-PCR法检测肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68 mRNA表达情况。结果 与正常组比较,脂多糖组大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能明显减弱(P<0.05),肺组织细胞凋亡率和血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显增高(P均<0.05),血清IL-10水平明显降低(P<0.05),肺细胞肿胀、变性及大量炎性细胞浸润,肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68蛋白阳性表达平均光密度值及mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05);与脂多糖组比较,槲皮素各组及地塞米松组大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能均明显增强(P均<0.05),槲皮素中、高剂量组及地塞米松组肺组织细胞凋亡率和血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显降低(P均<0.05),槲皮素各剂量组血清IL-10水平均明显升高(P均<0.05),槲皮素高剂量组肺组织病理损伤明显改善,槲皮素中、高剂量组PPARγ、LXR-α、CD68阳性表达平均光密度值和PPARγ、LXR-α、CD68 mRNA相对表达量均明显高于脂多糖组(P均<0.05),地塞米松组PPARγ和CD68阳性表达平均光密度值、PPARγ和LXR-α mRNA相对表达量均明显高于脂多糖组(P均<0.05)。结论 槲皮素可增强脂多糖诱导急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能,减轻肺组织病理损伤,其机制可能与激活PPARγ/LXR-α信号通路有关。

tRF-013354介导阿霉素诱导的足细胞损伤的机制研究

目的:探究tRNA衍生片段013354(tRF-013354)在阿霉素(ADR)诱导的足细胞损伤中的作用及相关机制。方法:用ADR诱导足细胞损伤模型,tRF-013354 mimic和tRF-013354 NC-mimic分别转染足细胞,Real-time PCR(RT-PCR)验证转染效率,CCK-8检测足细胞存活率,免疫荧光检测足细胞损伤标志物Nephrin、Podocin的定位和表达水平,Western blot检测Nephrin、Podocin和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白非磷酸化β-catenin、Wnt1的蛋白表达水平,RT-PCR检测tRF-013354的表达;用Wnt信号拮抗剂Dickkopf-1(DKK1)阻断Wnt/β-catenin信号通路,Western blot检测非磷酸化β-catenin和Nephrin、Podocin的蛋白表达水平,RT-PCR检测tRF-013354的表达。结果:1μg/mL ADR干预足细胞24 h,可成功构建ADR诱导足细胞损伤模型,Wnt/β-catenin信号通路被激活,tRF-013354下调(P<0.05);足细胞过表达tRF-013354可减轻足细胞损伤;DDK1阻断Wnt/β-catenin信号通路,与ADR组比较,ADR+DKK1组足细胞损伤减轻,tRF-013354表达上调(P<0.05)。结论:tRF-013354可能作为Wnt/β-catenin信号通路的下游效应分子减轻ADR诱导的足细胞损伤。

间充质干细胞来源的外泌体miR-3614-5p通过抑制铁死亡改善模型大鼠先兆子痫进展的机制研究

目的研究间充质干细胞来源外泌体微小核糖核酸-3614-5p(miR-3614-5p)对模型大鼠先兆子痫(preeclampsia,PE)进展的调节作用及相关机制。方法将36只SD大鼠(24只雌性和12只雄性)以雌雄比例2∶1合笼饲养自然受孕。24只妊娠大鼠随机分为假手术组(sham组)、PE模型组(PE组)和外泌体miR-3614-5p组(PE+exo组),每组8只。PE组通过皮下注射100 mg/kg的NG-硝基-L-精氨酸甲酯建立大鼠PE模型;PE+exo组构建PE模型,同时在第14天腹腔注射160μg/ml的外泌体悬液(0.5 ml/只/天),连续6天,实验持续21天;sham组则给予等量生理盐水。在妊娠第0,7,14和21天测量血压和尿蛋白浓度。RT-qPCR检测miR-3614-5p水平及B细胞淋巴瘤病-2(Bcl-2)、Bcl相关X蛋白(Bax)的mRNA水平;ELISA检测Caspase-3活性、活性氧(ROS)水平及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和亚铁离子(Fe2+)含量;Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白水平。结果与sham组大鼠相比,PE组大鼠的胎盘组织(0.43±0.05 vs 1.01±0.07)和外周血(0.51±0.07vs 1.01±0.12)中miR-3614-5p表达显著下调,差异具有统计学意义(t=19.070,10.180,均P<0.01)。与上清液相比,源自MSCs的外泌体中miR-3614-5p显著富集。与sham组相比,PE组大鼠第21天的舒张压(175.43±6.02 mmHg vs113.26±5.11 mmHg)、收缩压(123.57±5.63 mmHg vs 82.63±5.26 mmHg)及尿蛋白含量(175.48±13.21 mg/ml vs67.65±5.76 mg/ml)显著升高(t=22.606,16.440,23.168,均P<0.01);与PE组相比,PE+exo组舒张压(124.57±5.33mmHg vs 175.43±6.02 mmHg)、收缩压(89.76±3.88 mmHg vs 123.57±5.63 mmHg)及尿蛋白含量(97.69±7.23 mg/ml vs 175.48±13.21 mg/ml)显著降低,差异具有统计学意义(t=18.493,13.577,16.713,均P<0.01)。与sham组相比,PE组大鼠胎盘组织中Caspase-3活性(238.56%±13.22%vs 100.12%±5.93%)、Bax水平(3.18±0.71 vs 1.01±0.11)、ROS水平(387.65%±25.98%vs 100.51%±5.89%)、MDA含量(33.21±3.17 nmol/mg vs 14.83±2.69 nmol/mg)和Fe2+浓度(38.77±6.53 nmol/ml vs 17.51±3.15 nmol/ml)显著升高,而Bcl-2水平(0.47±0.08 vs 1.01±0.12)、GSH含量(4.12±1.22 nmol/mg vs 9.76±0.93 nmol/mg)、GPX4蛋白(0.48±0.06 vs 1.01±0.24)和SLC7A11蛋白(0.51±0.11vs 1.01±0.11)水平则显著降低(t=6.459~32.863,均P<0.01);与PE组相比,PE+exo组胎盘组织中Caspase-3活性(117.35%±8.67%vs 238.56%±13.22%)、Bax水平(1.13±0.45 vs 3.18±0.71)、ROS水平(128.73%±14.37%vs387.65%±25.98%)、MDA含量(18.13±3.89 nmol/mg vs 33.21±3.17 nmol/mg)和Fe2+浓度(19.05±3.45 nmol/ml vs38.77±6.53 nmol/ml)显著降低,而Bcl-2水平(1.04±0.11 vs 0.47±0.08),GSH含量(7.86±1.07 nmol/mg vs 4.12±1.22nmol/mg),GPX4蛋白(0.98±0.14 vs 0.48±0.06)和SLC7A11蛋白(1.11±0.09 vs 0.51±0.11)水平则显著升高,差异具有统计学意义(t=6.093~29.633,均P<0.01)。结论miR-3614-5p在PE模型大鼠的胎盘组织和外周血中显著下调。MSCs来源的外泌体miR-3614-5p通过抑制铁死亡改善大鼠的PE进展。MSCs来源的外泌体miR-3614-5p可能是PE治疗的一个新的潜在的生物标志物。

TLR4/miR-223/NLRP3信号通路的表达与脑卒中后抑郁大鼠海马炎症反应的关系

目的探究Toll样受体4(TLR4)/miR-223/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路的表达与脑卒中后抑郁(PSD)大鼠海马炎症反应的关系。方法30只3月龄SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为假手术组,PSD模型组和TLR4抑制剂组,各10只。PSD模型组和TLR4抑制剂组建立PSD模型,TLR4抑制剂组给予0.3 mg/kg的TAK-242溶液腹腔注射,其余各组均腹腔注射等体积的生理盐水溶液,5次/周,连续4周。评定各组大鼠的神经行为学,ELISA法检测血清白介素-1β(IL-1β)和IL-10的表达水平,RT-PCR测定海马组织中TLR4/miR-223/NLRP3信号通路相关基因的表达,Western blot测定TLR4/miR-223/NLRP3信号轴蛋白的相对表达。结果与假手术组相比,PSD模型组和TLR4抑制剂组大鼠Longa评分以及血清IL-1β和IL-10的表达升高,糖水偏嗜比(SP)、移动情况(LA)显著降低(P<0.05);与PSD模型组相比,TLR4抑制剂组大鼠Longa评分以及血清IL-1β和IL-10的表达表达下降、LA和SP升高(P<0.05)。与假手术组相比,PSD模型组大鼠海马组织中TLR4 mRNA、miR-223和NLRP3 mRNA以及TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相对表达均显著升高(P<0.05);与PSD模型组相比,TLR4抑制剂组的TLR4 mRNA和NLRP3 mRNA以及TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相对表达显著降低,miR-223的表达显著升高(P<0.05)。结论TLR4/miR-223/NLRP3信号转导通路与PSD海马炎症反应密切相关,通过调控TLR4/miR-223/NLRP3信号转导通路可能成为临床防治PSD的新靶位和新思路。

miR-34a-5p通过靶向IMP3、PD-L1对乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的探究miR-34a-5p通过靶向胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白3(IMP3)、程序性死亡配体-1(PD-L1)表达对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法利用Human Protein Atlas和GEPIA在线分析TCGA数据库和GTEx项目中乳腺癌及正常组织IMP3、PD-L1的表达水平、患者的预后生存期;qRT-PCR、Western blot检测160例患者乳腺癌组织及癌旁正常组织中miR-34a-5p、IMP3、PD-L1 mRNA与蛋白表达;Pearson检验分析miR-34a-5p分别与IMP3 mRNA、PD-L1 mRNA的相关性;免疫组化检测患者乳腺癌及正常组织IMP3、PD-L1、白细胞分化抗原44变异体6(CD44v6)的表达,分析IMP3、PD-L1表达水平与患者临床病理参数的关系;靶基因预测、双荧光素酶报告实验验证miR-34a-5p对IMP3、PD-L1的靶向调控作用。MCF7细胞分为control组、miR-NC组、miR-34a-5p组、miR-NC+pcDNA-NC组、miR-NC+IMP3组、miR-NC+PD-L1组、miR-34a-5p+pcDNA-NC组、miR-34a-5p+IMP3组和miR-34a-5p+PD-L1组,采用MTT法、克隆形成、划痕、Transwell小室实验测定细胞增殖活力、迁移、侵袭能力;Western blot检测IMP3、PD-L1、CD44v6、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平。结果生物数据库显示乳腺癌组织IMP3、PD-L1表达水平越高,患者生存期越短(P<0.05);qRT-PCR、Western blot结果显示,乳腺癌组织miR-34a-5p表达水平明显低于正常组织,IMP3、PD-L1 mRNA与蛋白表达水平明显高于正常组织,miR-34a-5p表达分别与IMP3 mRNA、PD-L1 mRNA呈明显负相关(P<0.05);免疫组化结果显示,乳腺癌组织IMP3、PD-L1、CD44v6呈阳性表达,且IMP3、PD-L1表达越高,TNM分期越晚,肿瘤分化程度越低、越容易发生淋巴结和远处转移(P<0.05);双荧光素酶实验验证了miR-34a-5p对IMP3、PD-L1的靶向调控作用;与control组和miR-NC组相比,miR-34a-5p组的细胞活力、单克隆形成数目、划痕愈合率、细胞侵袭数目、IMP3、PD-L1、CD44v6、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显降低,E-cadherin蛋白表达明显升高,与miR-NC+pcDNA-NC组相比,miR-NC+IMP3组和miR-NC+PD-L1组细胞活力、单克隆形成数目、划痕愈合率、细胞侵袭数目、IMP3、PD-L1、CD44v6、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显升高,E-cadherin蛋白表达明显降低,与miR-34a-5p+pcDNA-NC组相比,miR-34a-5p+IMP3组和miR-34a-5p+PD-L1组细胞活力、单克隆形成数目、划痕愈合率、细胞侵袭数目、IMP3、PD-L1、CD44v6、MMP-2、MMP-9水平升高,E-cadherin水平降低(P<0.05)。结论miR-34a-5p能够通过靶向调控IMP3、PD-L1表达抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质化(EMT)。

慢性肾病微炎症大鼠肠源性外泌体携带miR-146a表达特性研究

目的 研究慢性肾病(chronic kidney disease, CKD)微炎症大鼠肠源性外泌体携带miR-146a的表达特性。方法 健康SPF级Wistar雄性大鼠16只,随机分为2组,分别为正常组、模型组。采用腺嘌呤诱导CKD大鼠模型。适应性喂养3 d后,大鼠灌胃腺嘌呤(冲击量220 mg/(kg·d),4周;维持量100 mg/kg, 3周,共7周)。实验终点,大鼠经麻醉后,腹中动脉取血,留取血清和EDTA抗凝血浆各一份。测定血清中的尿素氮(BUN)、肌酐(Cr);酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;制备肾组织病理切片,苏木-伊红染色(HE)观察肾组织形态,马松(Masson)染色观察肾纤维化程度;透射电镜观察肠组织超微结构和外泌体分泌情况;试剂盒法提取血浆外泌体,超高速离心法提取肠道组织中外泌体;负染电镜技术鉴定外泌体形态;NTA技术测定外泌体粒径;免疫蛋白印迹法(Western blot)测定外泌体表面生物标记物;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测血浆外泌体中携带的微小RNA-146a(miR-146a)表达水平;Western blot法测定肠道组织肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)、核因子-κB(nuclear factor-κB signalling pathway, NF-κB)、Toll样受体4(TLR4)炎性信号通路蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组灌胃腺嘌呤7周后,构建CKD大鼠模型,模型大鼠的血清BUN、Cr水平显著增加(P<0.01)。模型组血清和回肠组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显高于正常组(P<0.01)。模型组肾病理显示肾小管明显萎缩、扩张,部分呈囊性病变,肾小管内大量褐色结晶,可见管型和再生;肾小球硬化,肾小球萎缩,鲍曼氏囊腔扩张,数目明显减少并大小不一;间质纤维化及炎性细胞浸润明显。模型组大鼠血浆和肠道组织中均可见粒径在155 nm的外泌体,透射电镜可见模型组大鼠的肠道组织释放出大量外泌体。模型组血浆外泌体携带miR-146a的表达显著高于正常组(P<0.01),而肠道组织外泌体携带miR-146a的表达却显著低于正常组(P<0.01)。结论 腺嘌呤导致大鼠肾功能损伤,肾组织形成病理性改变,伴发全身微炎症。同时,CKD大鼠肠道组织分泌并释放外泌体,使血浆中外泌体携带miR-146a被激活增加。

Neural stem cell-derived exosomes regulate cell proliferation,migration,and cell death of brain microvascular endothelial cells via the miR-9/Hes1 axis under hypoxia

Background:Our previous study found that mouse embryonic neural stem cell(NSC)-derived exosomes(EXOs)regulated NSC differentiation via the miR-9/Hes1 axis.However,the effects of EXOs on brain microvascular endothelial cell(BMEC)dysfunction via the miR-9/Hes1 axis remain unknown.Therefore,the current study aimed to determine the effects of EXOs on BMEC proliferation,migration,and death via the miR-9/Hes1 axis.Methods:Immunofluorescence,quantitative real-time polymerase chain reaction,cell counting kit-8 assay,wound healing assay,calcein-acetoxymethyl/propidium iodide staining,and hematoxylin and eosin staining were used to determine the role and mechanism of EXOs on BMECs.Results:EXOs promoted BMEC proliferation and migration and reduced cell death under hypoxic conditions.The overexpression of miR-9 promoted BMEC prolifera-tion and migration and reduced cell death under hypoxic conditions.Moreover,miR-9 downregulation inhibited BMEC proliferation and migration and also promoted cell death.Hes1 silencing ameliorated the effect of amtagomiR-9 on BMEC proliferation and migration and cell death.Hyperemic structures were observed in the regions of the hippocampus and cortex in hypoxia-induced mice.Meanwhile,EXO treatment improved cerebrovascular alterations.Conclusion:NSC-derived EXOs can promote BMEC proliferation and migra-tion and reduce cell death via the miR-9/Hes1 axis under hypoxic conditions.Therefore,EXO therapeutic strategies could be considered for hypoxia-induced vascular injury.