两种海人酸癫痫小鼠模型的建立及比较研究

目的比较分析海人酸(kainic acid,KA)侧脑室(intracerebroventricular,ICV)注射和腹腔注射(intraperitoneal injections,IP)两种给药路径建立的颞叶癫痫小鼠模型早期的行为学和病理学差异。方法100只C57BL/6N野生型(wild type,WT)雄性小鼠(体质量为20~22 g),按随机数字表法分为4组:ICV+normal saline(NS)对照组(n=10),ICV+KA模型组(n=40),IP+NS对照组(n=10),IP+KA模型组(n=40)。ICV+KA模型组使用600 nL的KA(0.5 mg/mL)进行侧脑室注射,IP+KA模型组按25 mg/kg剂量进行腹腔注射,对照组使用等量的生理盐水进行侧脑室和腹腔注射。建立模型3 d后,进行行为学、分子生物学(Western blot)和神经病理损伤评估(FJB染色,TUNEL染色,免疫荧光染色)。结果两对照组无痫性发作,两模型组均出现痫性发作。IP+KA组与ICV+KA组死亡率分别为47.50%和65.00%,造模成功率分别为80.00%与60.00%。与IP+KA组比较,ICV+KA组小鼠模型成功率明显增高而死亡率明显减少。FJB染色和TUNEL染色结果显示,与IP+KA组比较,ICV+KA组海马的神经变性和凋亡改变程度变化更加明显(P<0.05)。与IP+KA组比较,ICV+KA组海马凋亡蛋白表达差异也有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光结果显示,ICV+KA和IP+KA组海马和皮层的星形胶质细胞和小胶质细胞较对照组明显激活(P<0.05),但是ICV+KA组海马和皮层的胶质细胞激活程度均强于IP+KA组(P<0.05)。ICV+KA组海马和皮层的GFAP和Iba-1蛋白表达均高于IP+KA组(P<0.05)。结论两种KA制备方法均可制备出成功的癫痫模型。但ICV路径制备癫痫小鼠具有更高的成功率和更少的死亡率,并且神经病理损害程度和胶质细胞激活程度更加明显。

miR-17-5p诱导小鼠肾足细胞系凋亡

目的探讨miR-17-5p在小儿肾病综合征(NS)发病中的作用及其机制。方法将miR-17-5p mimic转染入小鼠肾足细胞系MPC5 24 h后收集细胞。通过microRNA.org、Target Scan和PicTar在线预测miR-17-5p对蛋白酪氨酸磷酸酶受体(PTPRO)-3′UTR区的调控作用。用RT-PCR和Western blot检测PTPRO mRNA以及蛋白的表达,Fluo-3-Am特异性Ca2+荧光指示剂检测足细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]),annexin V/PI双染色流式细胞计量术检测足细胞凋亡率。结果生物信息学技术预测,小鼠源及人源miR-17-5p都有多个位点结合于相应的PTPRO-3′UTR区,并抑制PTPRO蛋白及mRNA的表达。PTPRO过表达抑制miR-17-5p诱导的足细胞[Ca2+]升高,PTPRO过表达减缓miR-17-5p mimic诱导的肾小球足细胞凋亡。结论miR-17-5p抑制小鼠肾足细胞内PTPRO表达,并激发肾小球足细胞[Ca2+]升高,诱导肾小球足细胞凋亡。

太赫兹辐射暴露致小鼠皮肤损伤效应研究

目的探讨太赫兹(terahertz,THz)辐射暴露所致皮肤组织损伤的生物效应特点及其潜在的分子机制。方法采用C57BL/6J小鼠为实验动物模型,通过频率为0.22 THz,平均功率密度为0、25、50 mW/cm^2的THz辐照动物,辐照时间为5 min,观察辐照引起的暴露部位皮肤升温曲线特点和皮肤组织病理损伤特征,同时通过对辐照部位皮肤组织进行转录组测序及生物信息学分析,揭示损伤的整体效应及潜在分子机制,并进一步通过ELISA验证RNA-seq揭示的相关效应。结果25 mW/cm^2 THz辐照不引起明显的升温效应,但50 mW/cm^2 THz辐照能够导致辐照动物皮肤平均温度迅速升高超过2℃,并且导致辐照部位皮肤组织出现上皮脱落及出血等病理损伤特征。通过对损伤皮肤组织进行转录组测序,共筛选出上调基因49个,下调基因27个。对这些基因进行GO及KEGG分析结果显示,其主要功能为调控机体组织免疫及炎症反应等。ELISA检测结果显示,THz暴露后皮肤炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论THz辐射导致暴露部位皮肤出现明显的热效应损伤及引起炎症反应等损伤效应,并导致一系列基因表达异常。

载10-羟基喜树碱脂质超声微泡的处方制备及一般特性研究

目的研究载10-羟基喜树碱(HCPT)脂质超声微泡的处方制备工艺,筛选出最佳处方制备载药微泡,研究微泡的一般特性及显影效果,并检测微泡的药物包封率和载药量。方法以机械振荡法制备载HCPT脂质超声微泡;采用正交试验优选处方;采用紫外分光光度法和反相高效液相色谱法测定微泡的包封率和载药量;在光学显微镜下计数并观察微泡的外观和分布情况;以马尔文激光粒径测量仪测量微泡粒径大小和Zeta电位;观察并比较微泡经^(60)Co射线灭菌前后其外观、形态、平均粒径和包封率的改变;并观察微泡在兔肝脏的增强显影效果。结果以最佳处方制备的载10-羟基喜树碱(2mg)微泡的药物包封率为86.70%,载药量为21.70%;浓度为(3.07±0.58)×109/ml,粒径范围为(1.10±0.20)μm,平均粒径为1.10μm;Zeta电位为-(3.90±0.80)mV;超声定向辐照微泡后,药物吸光度值明显增加;经^(60)Co射线灭菌后观察微泡形态、平均粒径及包封率无明显变化;静脉注射此载药微泡后,兔肝脏超声显影持续增强。结论采用机械振荡法制备的载HCPT脂质微泡,包封率和载药量较高,粒径分布均匀,体内显影效果好,有望实现实时监控下的体内定点靶向给药,为进一步研究奠定了基础。

太赫兹辐射暴露引起小鼠视网膜基因表达改变

目的探讨太赫兹(terahertz,THz)辐射暴露后视网膜组织基因表达变化的整体情况,揭示THz暴露所致视觉系统损伤效应的关键信号通路及关键基因。方法通过平均功率密度80 mW/cm^2的THz辐射暴露小鼠眼部,暴露时长2 min,取暴露后视网膜组织,采用RNA-seq测序分析基因表达变化的整体差异,采用聚类分析及富集分析揭示差异基因富集的信号通路和所揭示的生物功能;并进一步通过Real-time PCR揭示THz辐射暴露对视网膜损伤关键基因表达影响的时效关系。结果以P<0.05、|logFC|≥1为筛选条件对差异表达基因进行筛选,共筛选出上调基因625个,下调基因9个。GO分析差异基因主要分布于细胞外成分,分子功能主要为影响蛋白结合等,生物功能主要为细胞应激反应与细胞增殖等。KEGG信号通路分析结果显示,差异基因主要影响PPAR信号通路、癌症相关信号通路、钙离子信号通路及PI3K-Akt信号通路。通过Real-time PCR对视网膜损伤相关基因进行验证发现,在暴露后5 min及24 h,THz辐射暴露均上调Krt12、Cfd、Wnt3a及Adipoq表达,下调Foxe3、Serpine3、Lix1、Rpe65、Rgr及Arsi基因表达,且暴露后5 min上调或下调幅度明显强于24 h。结论THz辐射能够导致视网膜大量基因表达异常,提示THz暴露可能造成视网膜损伤。

一种昆明种属来源的视网膜变性小鼠同源导入C57BL/6J小鼠近交系的表型研究

目的将本实验室发现的一种昆明种属来源的自发性遗传性视网膜变性小鼠(暂命名为KMrdf/rdf小鼠)的致病基因同源导入C57BL/6J小鼠,培育一种新的近交系小鼠(暂命名为B6rdf/rdf小鼠),并对B6rdf/rdf小鼠进行眼部表型的发育学研究。方法采用眼底照相、眼底荧光素血管造影、组织形态学和视网膜电图观测不同年龄B6rdf/rdf小鼠的眼部表型。结果眼底照相和荧光素血管造影发现B6rdf/rdf小鼠表现为进行性视网膜血管退化及脱色素改变,视网膜组织形态学表现为外核层在P14显著变薄,外核层和外网状层至P21已基本消失,视网膜电图自P14已记录不到明显波形。结论 B6rdf/rdf小鼠眼部表型呈快速进行性改变,与KMrdf/rdf小鼠表型相似。

改良蕈样膀胱插管技术在家兔尿生成实验中的应用

目的应用改良蕈样膀胱插管技术进行家兔尿生成实验,探讨改良蕈样膀胱插管技术的导尿效果。方法随机抽取10组学生完成家兔改良蕈样膀胱插管,观察静脉注射50%葡萄糖、0.1%呋塞米和0.01%去甲肾上腺素溶液前后家兔尿量的变化。结果应用改良蕈样膀胱插管技术的家兔导尿尿滴数为(55±16)滴/分,静脉注射50%葡萄糖溶液[(85±17)滴/分]和0.1%呋塞米溶液[(135±22)滴/分]后增加尿量,静脉注射0.01%去甲肾上腺素溶液[(65±20)滴/分]后尿量减少(P<0.01)。结论改良蕈样膀胱插管技术导尿效果显著,葡萄糖和呋塞米具有明显的利尿作用,而去甲肾上腺素具有抑制尿生成的效果。

0.22太赫兹电磁辐射暴露致神经母细胞瘤Neuro-2a细胞损伤的非热效应研究

目的探讨0.22太赫兹(terahertz,THz)电磁辐射暴露致小鼠神经母细胞瘤细胞株——Neuro-2a细胞损伤的非热效应特点。方法以Neuro-2a细胞作为体外实验暴露模型,采用频率为0.22 THz,平均功率密度为0(Sham组)、25(25 mW/cm^2辐照组)、50 mW/cm^2(50 mW/cm^2辐照组)辐照细胞,辐照时间为5 min,监测辐照引起的细胞培养基温度变化;于暴露后24 h检测细胞增殖(EdU阳性细胞比例和细胞活力)、凋亡(γH2AX、TUNEL阳性细胞比例、Bax与Bcl2基因表达水平);于暴露后48 h分析细胞突触生长(突触长度、分支数目及Tubb3与Syp基因表达水平)的变化情况。结果与Sham组比较,两辐照组细胞培养基温度升高在0.1~0.4℃;EdU阳性细胞比例、细胞活力、γH2AX和TUNEL阳性细胞比例及Bax、Bcl2基因表达水平均无明显改变;仅50 mW/cm^2辐照组细胞突触长度和分支数目较Sham组明显减少(P<0.01),Tubb3和Syp基因表达也明显降低(P<0.05)。结论THz辐射暴露以非热效应为主,可抑制Neuro-2a细胞突触生长,而不影响细胞增殖和凋亡,提示神经细胞突触生长是THz辐射产生神经生物效应的敏感靶标。

小鼠膀胱内压力与尿道外括约肌肌电图同步测定方法的建立与验证

目的建立小鼠膀胱内压力(cystometrography,CMG)与尿道外括约肌肌电图(external urethral sphincter electromyography,EUS EMG)同步测定的方法,并验证其可靠性。方法将12只年龄、体质量相仿的雌性小鼠麻醉后予以耻骨上膀胱造漏并植入导管,然后进行CMG和漏尿点压(leak point pressure,LPP)测定与同步EUS EMG记录。完毕后离断双侧阴部神经,再次重复CMG、LPP及EUS EMG测定,以检测EUS EMG信号的准确性。神经损伤前后计量资料之间的比较采用配对t检验。结果在未损伤阴部神经时,EUS EMG在LPP处的振幅和频率[(111.7±19.4)μV和(142.6±15.0)Hz]较基础膀胱压时的振幅和频率[(38.9±8.4)μV和(37.6±9.5)Hz]有明显的增加(P<0.001)。定量分析排尿期所出现的"EUS EMG间断性扑动"信号发现:振幅与频率分别为(70.4±15.2)μV和(393.8±118.9)Hz,单次扑动的持续时间:(85.60±6.21)ms,两个扑动信号之间的间隔时间:(222.0±44.2)ms。而双侧阴部神经离断后,EUS EMG信号几乎完全不能被检测到,说明肌电图信号的真实性。另外,LPP、顶点膀胱压与排尿时的最大膀胱压在离断双侧阴部神经后出现了显著的降低,分别为[(16.4±1.2)cm H2O vs(7.4±0.7)cm H2O,P<0.001;(26.7±1.7)cm H2O vs(15.9±1.1)cm H2O,P<0.001;(35.5±2.0)cm H2O vs(22.8±1.1)cm H2O,P<0.001]。结论成功建立并验证了CMG与EUS EMG同步测定在小鼠模型上的可行性。

HCN1通道基因敲除下调小鼠膀胱Cajal间质细胞中BK通道的表达及功能

目的观察小鼠HCN1通道基因敲除对其膀胱Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)中BK通道的表达和功能的影响,探讨这种影响对膀胱兴奋性调控的意义。方法健康清洁成年的野生型C57BL/6J小鼠和HCN1通道基因敲除的C57BL/6J小鼠各48只(雌雄各半)分别记为正常组和敲基因组,反转录PCR(RT-PCR)、荧光定量PCR(Q-PCR)、Western blot和免疫荧光双标检测其膀胱ICCs中BK通道各亚基的表达变化,离体逼尿肌肌条实验检测加入BK通道阻滞剂IBTX前后肌条收缩的变化,激光共聚焦显微镜下检测分别加入BK通道激动剂NS1619、阻滞剂IBTX前后小鼠膀胱ICCs内钙荧光的变化。结果 Q-PCR显示敲基因组小鼠膀胱中BK通道α、β1、β2、β3、β4各亚基表达均降低(P<0.01);Western blot显示敲基因组小鼠膀胱中BK通道α、β1、β2、β3、β4亚基表达均降低(其中α、β3、β4:P<0.01;β1、β2:P<0.05);免疫荧光双标显示敲基因组小鼠膀胱ICCs中BK通道α亚基表达降低(P<0.01);离体逼尿肌肌条实验显示加入IBTX后敲基因组和正常组肌条收缩幅度均变大(P<0.01,P<0.05),且敲基因组肌条收缩幅度的变化值小于正常组(P<0.05);激光共聚焦显微镜下可见加入NS1619后两组ICCs内钙荧光均降低(P<0.05)、加入IBTX后两组ICCs内钙荧光均增强(P<0.01),且不论加入激动剂或阻滞剂,敲基因组加药前后ICCs内钙荧光的变化值均小于正常组(P<0.01)。结论小鼠HCN1通道基因敲除下调了其膀胱ICCs中BK通道的表达及功能,这种下调可能是对HCN1通道基因敲除后膀胱收缩减弱的一种代偿。