造血发育和内皮细胞的关系

研究造血和血管内皮在胚胎发育中的关系,包含对造血细胞和内皮细胞的发育起源以及相关分子调控的探讨。以已有的研究结果为基础,对造血细胞和血管内皮细胞发育关系提出了成血血管细胞(hemangioblast)和生血内皮(hemogenic endothelium)的两种模式。在卵黄囊和P-Sp/AGM区,造血和内皮细胞的发育关系分别表现出不同的特点:二者在卵黄囊共同来源于成血血管细胞;在AGM区则更多表现为生血内皮的模式。造血和血管内皮相关分子的表达和调控作用的研究,不仅体现了造血和内皮在发育中的密切关系,同时也加深了对造血发育调控的认识。本文就原始造血和永久造血的发育、造血和血管内皮发育相关的两种模式及造血和内皮发育相关分子问题进行了综述。

脐带血清体外培养临床应用人骨髓间充质干细胞的方法研究

目的:观察脐带血清等4种不同培养体系体外培养人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的效果,建立一种适合临床移植需要的人BM-MSCs培养方法。方法:从20例新鲜成人骨髓穿刺液中分离BM-MSCs,分别用含10%脐带血清、胎牛血清(FCS)、成人血清的DMEM/F12培养基和MesenCult培养基培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组BM-MSCs定向分化。结果:采用4种培养体系都能从骨髓液中分离培养出BM-MSCs,脐带血清和MesenCult组培养的BM-MSCs在增殖数量和速度上相似,而优于FCS和AB型血清组。脐带血清和MesenCult组培养的BM-MSCs表达CD29、CD73、CD105的阳性率比FCS和AB型血清组高(均P<0.05),而CD31阳性率低于FCS和AB型血清组(P<0.05),脐带血清和MesenCult组培养的BM-MSCs诱导为成骨细胞和脂肪细胞阳性率高于FCS和AB型血清组(P<0.05)。结论:脐带血清与MesenCult组培养的BM-MSCs的纯度和体外诱导分化能力相似,优于FCS和AB型血清组,脐带血清适合临床应用。

骨髓间充质干细胞体外诱导和端粒酶活性的研究

目的:建立骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养、纯化的方法,探讨其体外诱导条件和端粒酶活性。方法:取正常成人骨髓用含10%小牛血清的LG-DMEM培养液培养、扩增。流式细胞仪行细胞表面抗原检测,细胞化学染色鉴定其生物学特性,在特定培养条件下检测其向成骨和脂肪细胞分化的能力,采用TRAP(Telomerase repeat amplification protocol assay)-银染法测定其端粒酶的活性。结果:分离培养获得的贴壁细胞,碱性磷酸酶染色阳性。流式细胞仪检测CD34、CD45表达阴性,CD29、CD44、CD115、CD166表达阳性。经向成骨和脂肪细胞诱导3周后,可得到成骨和脂肪细胞,经茜素红染色、油红O染色得到证实。TRAP-银染法证实MSCs表达一定的端粒酶活性。结论:体外分离培养的MSCs可以向成骨、脂肪诱导分化,表达一定的端粒酶活性,具有干细胞的生物学特性。

骨髓铁染色简化操作步骤的研究

目的:探讨更简单快捷的骨髓铁染色方法。方法:试验4%盐酸、40g/L亚铁氰化钾及2者等体积混合液3种方法固定外周血涂片及骨髓涂片的效果。对50例住院患者骨髓涂片分别采用常规方法和省略甲醇固定步骤的简化方法做铁染色,随机双盲观察细胞外铁和细胞内铁。结果:血涂片及骨髓涂片经4%盐酸和40g/L亚铁氰化钾的等体积混合液处理全部固定良好,而经4%盐酸、40g/L亚铁氰化钾作用全部未固定。经秩和检验比较50份骨髓涂片2种方法铁染色外铁及内铁结果无差异。结论:4%盐酸和40g/L亚铁氰化钾的等体积混合液对骨髓涂片除染色作用还兼有优良的固定作用;简化方法突显简单省时、省试剂、少污染的优点,适应临床即时性需求。

成人骨髓间充质干细胞对K562细胞生长的影响

目的:研究成人骨髓间充质干细胞(MSCs)对K562细胞生长的影响。方法:从成人骨髓中分离、培养MSCs,并通过其形态的均一性及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度,观察其电镜下的超微结构。将分离培养的MSCs置于24孔板中,72 h待其贴壁后,以丝裂霉素处理,与K562细胞共培养,计数法测定细胞增殖,观察成人骨髓MSCs对K562细胞生长的影响。结果:和单独的K562细胞生长曲线相比,与骨髓MSCs共孵育的K562细胞生长缓慢,无明显的指数生长期。结论:成人骨髓MSCs抑制K562细胞的生长,提示其可能有潜在的抗肿瘤作用,但其作用机制如何有待于进一步探讨。

人骨髓间充质干细胞体外培养扩增及向心肌细胞诱导分化的实验研究

目的:培养人骨髓间充质干细胞(Human mesenchymal stem cell,hMSCs),探讨hMSCs体外向心肌细胞(Cardio-myocytes,CM)定向诱导分化的实验研究。方法:取人的骨髓血,用Percoll(1.073g/ml)密度梯度离心及贴壁筛选结合的方法体外培养扩增hMSCs,并进行流式细胞仪分析鉴定其免疫学表型,以未加一抗只加二抗的hMSCs作为平行对照组。选用生长良好、纯度达到95%的P5代hMSCs,用不同诱导浓度的5-氮杂胞苷(5-Azacytidine)1、5、10和20μmol/L进行诱导,对诱导后的细胞进行心肌特异性标志TroponinⅠ及Desmin的免疫组化鉴定。结果:体外分离纯化培养扩增出hMSCs,其CD44阳性率平均为93.26%±2.48%,与平行对照组(3.42%±1.09%)相比有明显差异(P<0.01)。经5和10μmol/L5-Aza诱导分化的hMSCs表达心肌特异性标记TroponinⅠ、Desmin;10μmol/L5-Aza诱导分化的hMSCs阳性率明显高于5μmol/L组;在20μmol/L组中,诱导后超过50%的细胞脱落死亡。结论:hMSCs可体外分离培养扩增,并具有向心肌细胞分化的潜能,5-Aza最佳诱导浓度为10μmol/L。

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导成骨细胞的研究

目的为建立一种简便有效的下颌骨缺损修复治疗的新方法——利用体外分离纯化人骨髓间充质干细胞(marrowstromal cells,MSCs),诱导向成骨细胞转化后再用于临床。方法 Ficoll密度梯度离心后贴壁培养法,分离纯化MSCs体外培养,经连续传代培养,加入10-7mol/L地塞米松,10-2mol/Lβ-甘油酸钠,500 ug/L的维生素C诱导液。结果 MSCs诱导后细胞形态向成骨细胞转化,经RT-PCR、流式细胞仪、细胞碱性磷酸酶活性、细胞糖原染色鉴定为成骨细胞。结论 hMSCs经定向诱导显示成骨细胞特性,为临床下颌骨缺损组织工程修复提供种子细胞。

成人骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的研究

目的:通过成人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)体外定向诱导为成骨细胞,探讨理想而有临床实用价值的成人骨髓MSC体外诱导培养体系。方法:体外分离、扩增成人骨髓MSC,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。采用基础诱导培养液[地塞米松、β-甘油磷酸钠、L-抗坏血酸加不同浓度的重组人转化生长因子-β1(recombinanthumantransforminggrowthfactor-beta1,rhTGF-β1)]诱导成人骨髓MSC体外分化为成骨细胞。利用倒置光学显微镜、透射电镜、四甲基偶氮唑盐(MTT)比色、碱性磷酸酶(ALP)染色、ALP活性测定等方法研究成人骨髓MSC增殖和分化情况。结果:成人骨髓MSC的增殖和分化作用和rhTGF-β1有剂量依赖关系,低浓度时促进增殖,高浓度抑制增殖,5μg/L浓度达到高峰,其浓度升高促进MSC分化。结论:含有rhTGF-β15μg/L的基础诱导培养液是理想且有临床实用价值的成人骨髓间充质干细胞体外诱导为成骨细胞的培养体系。

大鼠骨髓基质细胞促进自体骨形成的实验研究

目的研究自体骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)体外诱导扩增与仿生纳米壳聚糖-胶原复合支架材料(nano chitosan sodium collagen scaffold,NCSCS)复合修复骨缺损的可行性。方法分离纯化Wistar大鼠BMSCs,诱导BM-SCs向成骨细胞(osteoblast,OB)转化,经碱性磷酸酶、茜素红组织化学染色鉴定,将BMSCs复合仿生纳米壳聚糖-胶原复合支架材料(nano chitosan sodium collagen scaffold,NCSCS)进行扫描电镜观察。制作Wistar大鼠胫骨骨缺损模型,缺损处NCSCS-BMSCs复合物移植后观察骨缺损修复成骨情况。结果扫描电镜下BMSCs细胞在仿生纳米壳聚糖-胶原复合支架材料上大面积生长。BMSCs复合仿生纳米壳聚糖-胶原复合支架材料植入2周后,材料周围可见大量纤维组织,并可见成骨细胞和少量新生的骨样基质,新生骨对照组和实验组比较差异显著(P<0.01);植入6周后,可见到材料与新生骨之间相互混杂,中有纤维相间隔,和原有骨界面尚清晰可辨认,材料部分降解,对照组和实验组比较新生骨有统计学差异(P<0.05);植入12周后,材料几乎降解完全,和天然骨组织界面可见新骨形成,对照组和实验组比较新骨形成无统计学差异(P>0.05)。材料降解在各时间段对照组和实验组比较差别不显著(P>0.05)。结论 BMSCs介导NCSCS修复骨缺损优于单纯的NCSCS修复骨缺损,尤以早期效果为好。

阿米福汀对甲氨蝶呤诱导细胞凋亡的保护作用

目的：研究体外培养条件下阿米福汀对甲氨蝶呤诱导正常骨髓单个核细胞凋亡的影响，探讨阿米福汀对甲氨蝶呤导致骨髓抑制的保护作用。方法：将24例特发性血小板减少性紫癜（ITP）患儿分离骨髓单个核细胞，分为空白对照组、甲氨蝶呤组、阿米福汀组、阿米福汀加甲氨蝶呤组，在不同时间点采用形态学观察法，DNA琼脂糖凝胶电泳，流式细胞术检测细胞凋亡的情况。结果：培养8、12、24、48h，甲氨蝶呤组均可见大量的凋亡细胞，阿米福汀加甲氨蝶呤组凋亡细胞明显减少，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：阿米福汀能抑制甲氨蝶呤诱导的正常骨髓单个核细胞凋亡，减少坏死。

撤除生长因子对间充质干细胞增殖和胞外基质表达的影响

目的:研究撤除表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的增殖和胞外基质(ECM)表达的影响。方法:将第5代hUCMSCs分3组:对照组(保持上述生长因子浓度不变),半量撤除组(使生长因子浓度减半),完全撤除组(不添加生长因子)。培养30h后瑞特-姬姆萨法染色观察细胞形态,MTT法细胞计数。培养15h后,定量PCR检测BCL-2、BAX及胞外基质基因的表达情况。结果:撤除生长因子后细胞增殖减慢,形态变大,核质比减小,BCL-2/BAX比率增高,胞外基质表达多数下调。半量撤除组细胞的形态、增殖能力、胞外基质表达的改变相对较小,BCL-2/BAX比率增高更明显。结论:撤除生长因子会影响细胞增殖和胞外基质的表达,保留半量生长因子可以改善这种情况。

两种检测方法对宫颈癌筛查敏感性和特异性的比较

目的比较两种检测方法对宫颈癌筛查的敏感性和特异性。方法收集无临床症状,行常规筛查的女性158例,对所有入选者均进行薄层细胞学检查与宫颈涂片检查,同时进行宫颈组织病理活检术,比较两种检测方法的敏感性和特异性。结果 (1)以病理活检作为标准,与宫颈涂片相比,薄层细胞学检查结果与病理活检结果较相似,两种检测方法检测结果差别具有统计学意义(P<0.05);(2)与宫颈涂片法相比,薄层细胞学检查对宫颈癌诊断的敏感性和特异性均较高,差别具有统计学意义(P<0.05)。结论门诊无临床症状行宫颈癌常规筛查的女性,与传统宫颈涂片法相比,薄层细胞学具有较高的敏感性与特异性,值得临床推广。

(±) Bay K8644提高衰老大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的探讨(±)Bay K8644对衰老的大鼠(24 m)来源的骨髓间充质干细胞(Aging bone marrow stromal cells,Aging-BMSCs)的骨向分化能力的影响。方法通过全骨髓贴壁培养法获得大鼠BMSCs,使用β-半乳糖苷酶染色方法鉴定细胞的衰老状态,随后应用(±)Bay K8644对细胞进行干预。以干性标志物Nanog为靶点,通过实时定量PCR筛选出(±)Bay K8644作用的最佳浓度,随后对细胞进行成骨分化诱导,并检测细胞在药物干预下的骨向分化能力的改变。在诱导第14天后对成骨分化标志酶碱性磷酸酶进行染色及活性测定、第21天后进行茜素红染色。结果(±)Bay K8644明显的降低了Aging-BMSCs细胞内β-半乳糖苷酶的含量(P<0.05),同时干细胞的干性标记物Nanog的表达明显提升(P<0.05)。对细胞进行成骨分化诱导后,成骨分化标志基因表达上调,ALP、茜素红染色的结果提示实验组骨向分化水平明显较对照组提升(P<0.05)。结论 (±)Bay K8644能够明显改善衰老骨髓间充质干细胞的衰老状态,并使其骨向分化的能力得到提升。

大鼠骨髓单个核细胞体外诱导向内皮分化的研究

目的 :为组织工程研究作准备 ,分离大鼠骨髓单个核细胞并诱导培养向内皮分化。方法 :成年SD大鼠 ,应用Ficoll淋巴细胞分离液 (密度1 .0 77g/ml) ,将长骨骨髓经非连续密度梯度离心 ,收集中层的单个核细胞 ,加入诱导培养基并置于纤维连接素包被的培养板上进行诱导分化 ,观察细胞生长状况 ,以透射电镜及Ⅷ因子、CD3 1、Lectin免疫组化以及流式细胞仪方法对培养细胞进行鉴定。结果 :细胞圆形、纺锤形单层融合贴壁生长 ;Ⅷ因子、CD3 1、Lectin免疫组化染色阳性 ;透射电镜显示细胞具有内皮特征性的Weibel Palade小体。结论 :采用Ficoll密度梯度离心可获得较高纯度的骨髓单个核细胞 ,经体外培养并诱导分化 。