山药多糖对体外培养大鼠胰岛细胞活性及胰岛素分泌的影响

为评价山药多糖对胰岛细胞功能的影响,以不同质量浓度葡萄糖刺激胰岛素释放,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测胰岛β细胞活性,同时以反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测胰岛细胞的抗凋亡基因bcl-2的表达,研究山药多糖与大鼠胰岛细胞共培养对胰岛细胞活性与胰岛素分泌水平的影响,并对其影响机制进行探讨.结果发现,1600 mg/L组胰岛细胞活性稍有下降,但是与对照组没有显著差异(p>0.05);其余各组随培养液中山药多糖质量浓度的增加,胰岛细胞活性增加.低糖或高糖质量浓度环境中实验组与对照组的胰岛素分泌没有显著差异(p>0.05),RT-PCR发现实验组的bcl-2表达显著高于对照组(p<0.05).800 mg/L山药多糖明显提高胰岛细胞的存活率,改善胰岛功能.

促性腺激素释放激素激动剂对大鼠睾丸间质细胞annexin 5和3β-HSD的表达影响

目的:探讨阿拉瑞林(GnRHa)对大鼠睾丸间质细胞中膜联蛋白V(annexin5)和3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)的表达的影响.方法:建立体外分离、纯化和培养大鼠睾丸间质细胞原代培养技术,采用3β-HSD免疫细胞化学方法对间质细胞进行鉴定,同时用不同终浓度的GnRHa(分别为1×10-5,1×10-6,1×10-7mol/L)作用于间质细胞24h后,通过Western Blot检测间质细胞中annexin5和3β-HSD的表达变化情况.结果:间质细胞经GnRHa处理后,Western Blot结果显示,与对照组相比,当GnRHa终浓度为1×10-5mol/L时,anenxin5的表达量显著升高了69.2%(P<0.01),3β-HSD的表达量也升高了25.2%(P<0.05);当GnRHa的终浓度为1×10-6mol/L和1×10-7mol/L时,anenxin5的表达量分别升高了61.5%(P<0.05)和16.64%(P>0.05),3β-HSD的表达量则无显著性变化,分别升高了7.7%(P>0.05)和2.22%(P>0.05).结论:GnRHa在原代培养的睾丸间质细胞中,对annexin5,3β-HSD的表达具有调节作用.

多囊卵巢综合征合并妊娠相关性暴发性1型糖尿病1例诊断及治疗分析

暴发性1型糖尿病（fulminant type 1 diabetes mellitus．FT1DM）是1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）的特殊类型，目前病因未明，可能与遗传、病毒感染、妊娠等有关。该病起病急，迅速进展为糖尿病酮症酸中毒（diabetic ketoacidosis，DKA），多数患者合并血淀粉酶、脂肪酶增高，常常容易被误诊为急性胰腺炎。

高脂喂养加单侧肾切除制作小鼠糖尿病肾病模型研究

目的探讨高脂喂养加单侧肾切除制作糖尿病肾病(DN)模型的可行性。方法 8周龄的MKR小鼠(骨骼肌特异性Insulin/IGF-1双受体缺失的转基因小鼠)60只,雌雄各半,随机分为3组,每组20只。空白组(基础饲料喂养),高脂组(高脂饲料喂养),模型组(高脂饲料喂养+单侧肾切除组)。造模后第1、2、4、6、8周测体质量、空腹血糖、尿微量白蛋白(UmAlb)。8周后心脏采血处死各组小鼠留取血标本及肾组织分别进行血肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)的检测及光镜和电镜下观察肾脏病理学改变。结果与空白组比,8周时,高脂组、模型组两组血糖明显升高(P<0.01),而两组之间比较,血糖无明显变化(P>0.05)。模型组UmAlb、Cr、BUN较空白组、高脂组明显升高,差异有显著统计学意义(P<0.01),且肾质量(KW),肾/体质量(KW/BW)较空白组显著增大,病理变化明显。结论高脂饲料喂养加单侧肾切除的MKR小鼠是一个良好的糖尿病肾病模型。

Beta肾上腺素能受体3种亚型基因的5位点SNP的基因型分布

目的 :研究Beta肾上腺素能受体 3种亚型基因的 5个位点的单核苷酸多态性基因型分布。方法 :用DNA提取试剂盒抽提 338例受试者外周血白细胞DNA ,用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性及等位基因特异性PCR技术获得Beta -AR 3种亚型基因的 5个位点的SNP基因型。结果 :分别获得了 338例受试者的Beta -AR 3种亚型基因的 5个位点中的每一位点的SNP基因型的自然分布特征。各位点的优势基因型为 :Beta2 -AR 4 9位的野生型纯合子Ser/Ser(70 % ) ,Betal-AR389位的野生型纯合子Arg/Arg(6 3% ) ,Beta2 -AR 16位的杂合子Arg/Gly(80 % ) ,Beta2 -AR 2 7位的杂合子 (Gln/Glu(5 0 % ) ,Beta3-AR 6 4位的野生型纯合子Trp/Trp(6 5 % )。 结论 :Beta -AR 3种亚型基因的 5位点中每位点的SNP基因型分布是非均匀的且各位点的分布特征是不同的 ,它是进一步研究其与功能和疾病的关系的基础。

汉族人群脂联素基因＋712A／G和＋349A／G多态性与2型糖尿病的关联性研究

目的探讨中国四川地区汉族人群脂联素基因(APM1)单核苷酸多态性(SNP)和2型糖尿病(T2DM)及其血脂水平的关联性。方法研究对象819例,包括对照组405例,T2DM组414例。测定血脂水平和腰臀比值(WHR);稳态模型(HOMA)计算胰岛素抵抗(IR)指数。PCR-RFLP和基因测序方法鉴定2号内含子(IVS2)+712A/G和+349A/G多态性。结果APM1基因IVS2+712A/G位点GG基因型与(AA+AG)基因型在对照组与T2DM组内的分布差异有统计学意义(P<0.05),T2DM组内GG基因型患者血浆总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)值均高于(AA+AG)基因型(P<0.05);IVS2+349A/G位点各基因型及等位基因频率在对照组与T2DM组内的分布差异无统计学意义(P>0.05),两组内各基因型间血脂水平差异无统计学意义(P>0.05);IVS2+712A/G与IVS2+349A/G存在强的连锁不平衡(D′=0.893)。结论APM1基因IVS2+712A/G位点GG基因型与T2DM及其血浆TC和LDL水平升高关联,A→G多态性提高了T2DM合并血脂代谢紊乱的风险性;IVS2+349A/G与+712A/G紧密连锁。

TCF7L2基因RNA干扰对胰岛素原水平的影响及机制

目的:研究转录因子7类似物2(transcription factor 7 like 2,TCF7L2)表达下调对胰岛素原水平的影响,进一步探讨TCF7L2通过前蛋白转化酶(proprotein convertase,PC)基因影响胰岛素原水平的机制。方法:在体外培养Beta-TC-6细胞株,通过构建TCF7L2的RNA干扰慢病毒转染细胞,下调TCF7L2的表达,实验分为3组,分别为空白对照组、乱序对照组和TCF7L2干扰组,采用qRT-PCR和Western blot检测TCF7L2和PC基因mRNA及蛋白水平的变化;收集上清液,采用ELISA方法测定基础和葡萄糖刺激状态下胰岛素和胰岛素原水平的变化。结果:慢病毒感染Beta-TC-6细胞48 h后,在荧光显微镜下观察慢病毒感染效率达95%以上,与空白对照组比较,TCF7L2 mRNA的干扰率约为75%(0.25±0.03 vs.0.97±0.11,P=0.000),蛋白质水平的干扰率约为50%(0.29±0.08 vs.0.57±0.09,P=0.008)。与乱序对照组比较,TCF7L2干扰组葡萄糖刺激后胰岛素水平明显降低(7.47±0.21)mU/L vs.(10.53±0.38)mU/L(P=0.000),而胰岛素原水平却明显增加(10.73±0.51)pmol/L vs.(7.81±0.29)pmol/L(P=0.001),且PC1和PC2的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。结论:TCF7L2基因的RNA干扰可能通过降低PC基因的表达,进而减少该酶对胰岛素原的加工,从而影响胰岛素原的水平。

纳米金标记细胞的荧光寿命成像及其三维重建

为了研究在基于纳米金的肿瘤光动力学疗法以及肿瘤热疗中纳米金在细胞中的分布及代谢,利用多光子荧光显微镜技术对在热疗中纳米金结合的肿瘤细胞进行了多次扫描成像,并采用一种基于区域的活动轮廓模型图像分割算法,对与纳米金结合的细胞的多光子荧光显微图像进行处理,在一幅具有多个细胞的图像中分割出单个细胞的轮廓。根据细胞断层切片图像的轮廓采用移动立方体算法,对细胞进行三维重建,绘制出细胞表面的三维模型,再利用纳米金的荧光寿命和光强来标定纳米金在细胞具体位置的分布。结果表明,在一定时间内,纳米金会进入细胞并在不同的区域内呈现一定的分布。这与抗原抗体结合会导致抗体的内化,从而使纳米金进入细胞内的事实相符。这种技术将会为更加直观、全面地研究纳米金与细胞的相互作用以及纳米金在细胞内具体位置(比如某个细胞器内的分布)提供一种可行的方法。

一种高效诱导胚胎胰腺细胞分化为内分泌细胞培养方法的建立

目的建立一种使胚胎胰腺细胞体外高效分化为成熟内分泌细胞的培养方法。方法体外分离小鼠12.5 d的胚胎胰腺,培养于下层为培养基的漂浮膜上7 d,采用免疫组织化学方法检测胰腺祖细胞标志胰腺十二指肠同源盒基因1(PDX-1)和神经源素3(Ngn3)的表达及内、外分泌细胞的标志胰岛素、胰高血糖素、羧肽酶表达,定量PCR检测培养过程中胰腺标志表达的变化。结果胚胎胰腺培养1 d后,有大量胰腺祖细胞标志表达,且这些胰腺祖细胞处于增殖状态。培养3 d后,仍有胰腺祖细胞的标志大量表达。培养7 d后,分化的胰腺表达成熟内、外分泌细胞的标志,且胰腺标志的表达与体内表达模式一致。结论建立了一种使胚胎胰腺细胞体外高效分化为成熟内分泌细胞的培养方法。

中国丙型肝炎病毒基因型分布回顾及Meta分析

目的分析中国大陆地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布特征。方法检索维普数据库、中国知网数据库、万方数据库和PubMed数据库中有关HCV基因型的原始研究文献,按照纳入排除标准剔除不合要求的文献,采用Stata软件进行构成比Meta分析。结果共纳入符合要求的文献40篇,对HCV各亚型进行构成比Meta分析,发现P<0.1,说明不能进行合并分析。不同地区的相同类型患者HCV基因型的分布特征存在明显差异。相同地区的不同类型患者HCV基因型分布特征也存在也明显差异。中国大陆地区HCV亚型仍以1b亚型为主,但6a亚型已超过2a亚型,成为第二大亚型;3b和3a亚型构成比呈增加趋势,其他亚型也在明显增多。结论中国大陆地区HCV亚型呈多样化发展,制定HCV感染防控措施应考虑时间及地域因素。

金纳米微粒辅助细胞激光热作用疗法研究

金纳米微粒对可见光的强吸收特性使得光能可以高效地转换为热能.由于金纳米微粒的尺度在几十纳米范围,并且很容易与其他生物体结合,因此可以在局部范围进行激光选择性加热,这非常适合作为分子或细胞的靶向.采用这种金纳米微粒辅助激光热作用方法,对牛肠碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase aP)的选择性破坏,细胞膜的通透性提高以及对细胞的选择性灭活进行了试验并得到了很好的结果.此外,还讨论了用这种方法进行基因转染以及选择性光热治疗一些疾病的可能性.

熊果酸共晶在大鼠体内的药代动力学

目的建立基于高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)的熊果酸血药浓度测定方法,考察熊果酸乙醇共晶在大鼠体内的相对生物利用度。方法采用口服灌胃方式给大鼠服用熊果酸及其乙醇共晶,分别于给药后0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00和12.00 h,大鼠眼眶后静脉丛取血。血浆经乙酸乙酯提取后,采用HPLC-MS测定血浆中熊果酸的浓度并绘制药代动力学曲线。方法的色谱条件为,固定相:Sino Pak-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5.0μm),流动相:甲醇-纯净水(含体积分数为0.02%的三乙胺)(体积比为90∶10),流速:0.5 m L·min-1,柱温:25℃,进样量:10μL。质谱条件为:采集方式:多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM),离子极性:负离子,离子源:电喷雾离子源,检测离子:熊果酸m/z=455.7、甘草次酸m/z=470.6,N2体积流量:35.0 L·min-1,加热温度:350℃。药动学数据处理采用中国药理学会编制的DAS 2.0药动学软件处理。结果熊果酸的线性为10~640μg·L-1,定量下限为10μg·L-1,日内、日间精密度(RSD)均小于10%,提取回收率为80.57%,熊果酸及其乙醇共晶在大鼠体内的血药浓度-时间过程均符合一室模型,其中熊果酸-乙醇共晶和熊果酸原料药经灌胃给药后,AUC0-12 h分别为(279.7±22.9)和(171.1±11.4)h·μg·L-1,AUC0-∞分别为(352.9±45.0)和(297.9±65.9)h·μg·L-1,ρmax分别为(83.5±4.1)和(44.01±2.79)μg·L-1。药动学参数经方差分析后均存在显著性差异(P<0.05)。结论该方法适用于熊果酸及其乙醇共晶在大鼠体内的血药浓度测定及药代动力学研究,熊果酸-乙醇共晶灌胃给药后明显提高其血药浓度,改善生物利用度。

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的:克隆小鼠pdx-1基因,构建其真核表达载体,并在小鼠胚胎干细胞中表达,为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法:PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因cDNA,酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组,将pdx-1基因cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点,形成重组载体pEGFP/pdx-1,转化大肠杆菌DH5α菌株,构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA,HindⅢ和BamHⅠ酶切,电泳,DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果:从小鼠胰腺cDNA扩增出876bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证,插入载体的DNA片段为pdx-1基因,插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13,24h后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论:小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功,为进一步研究其功能奠定了基础。

去势大鼠体温改变与下丘脑视前区5-HT_(2A)受体表达

目的观察大鼠去势后体温改变与下丘脑视前区5-羟色胺2A(5-HT2A)受体亚型表达之间的关系。方法用数字温度计TM902C检测大鼠的肛温,酶联免疫吸附试验测定血清激素水平,根据5-HT2A受体互补DNA序列合成相应的特异性引物,用PCR法观察大鼠去卵巢后下丘脑视前区5-HT2A受体表达。结果①大鼠去势组(OVX)自第八周末肛温明显高于假去势(sham)组(P<0.05)。②OVX组大鼠血清17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)较sham组下降,LH水平升高,差异显著(P<0.05)。③OVX组下丘脑视前区5-HT2A受体表达增强,与sham组比较有显著性差异(P<0.05)。结论大鼠卵巢摘除后体温升高,下丘脑视前区5-HT2A受体表达增强,提示5-HT在低雌激素状态下的体温升高调节中起一定作用。

1种新型功能性杂交胰岛β细胞系的建立

目的通过应用基因转染及细胞融合技术构建永生化细胞,建立1种功能良好、无致瘤性、增殖可控的杂交胰岛β细胞系。方法通过脂质体介导逆转录病毒载体SSR69转染至原代成纤维细胞中,筛选稳定表达SV40 LTag的永生化细胞。提取大鼠胰岛,通过胰蛋白酶及DNA酶裂解成单胰岛细胞。对永生化成纤维细胞及单个胰岛β细胞进行电融合,通过有限稀释法获得杂交胰岛β细胞克隆。比较杂交及正常β细胞内胰岛素的含量及对葡萄糖刺激胰岛素释放反应。通过RT-PCR及Westernblot分析杂交胰岛β细胞中SV40 LTag、insulin、葡萄糖激酶(GK)及葡萄糖转运体-2(Glut-2)基因的表达。结果建立的永生化成纤维细胞系的增殖能力明显优于原代成纤维细胞(P<0.05)。成功获得杂交胰岛β细胞克隆,其细胞呈短梭形或扁圆形,且具有贴壁生长等特性。透射电子显微镜下可见细胞内胰岛素分泌颗粒,杂交与正常胰岛β细胞之间细胞内胰岛素含量、胰岛素释放指数及insulin、GK、Glut-2蛋白及mRNA表达水平无统计学差异(P>0.05),但2种细胞内insulin、GK、Glut-2的表达水平显著高于RIN-m5F细胞(P<0.05)。结论可通过永生化成纤维细胞及单个胰岛β细胞电融合诱导生成杂交胰岛β细胞,且杂交细胞能够对葡萄糖的变化产生应答反应。

GILZ真核表达载体的构建及其表达定位

目的:克隆、构建HA标签的糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白GILZ表达载体,观察其在细胞中表达与定位,为研究GILZ在脂肪细胞分化中的作用提供工具。方法:采用逆转录PCR(RT-PCR)法从C3H10T1/2细胞中扩增带有HA标签的GILZcDNA编码区,并将其重组于真核表达载体pcDNA3中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过Lipofectamine2000脂质体和CaCl2方法,分别转染C3H10T1/2和293T细胞,用HA抗体免疫荧光和免疫印迹法检测GILZ在细胞内的表达、分布及分子量大小。结果:HA-GILZ表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在C3H10T1/2和293T细胞中获得了高效表达。在荧光显微镜下,GILZ主要表达于细胞质内,分子量约20kD。结论:成功构建HA-GILZ基因表达载体并表达于C3H10T1/2细胞质中,为GILZ的功能研究奠定了基础。

补肾养血法治疗黄体功能不全的临床研究

目的:探讨补肾养血法治疗黄体功能不全(LPD)的临床疗效。方法:根据LPD的西医诊断标准,将80例LPD患者随机分为对照组、试验组,对其治疗后黄体中期孕酮水平、基础体温类型、HPS评分进行评价,从而观察补肾养血法对LPD患者的临床疗效。结果:治疗后两组患者黄体中期孕酮水平、HPS评分及BBT类型较治疗前差异有统计学意义(P<0.05),且试验组效果明显优于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:补肾养血法治疗黄体功能不全疗效显著,值得临床推广。

胰岛生理与糖尿病关系的研究进展

糖尿病是威胁人类健康的重要疾病之一,发病率在我国逐年上升,给家庭和社会带来沉重负担。胰腺是维持体内血糖水平衡定的最重要的器官,尤其是胰岛的生理功能对维持机体血糖的稳定发挥着至关重要的作用。各种刺激导致胰岛损伤、胰岛β细胞数量减少、胰岛素分泌缺陷以及胰岛素抵抗,进而引发糖尿病。通过研究胰岛生理与糖尿病的关系,有助于进一步了解糖尿病的发病机制以及研究治疗方案。