重组抗LMP1单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建及表达

目的体外拼装人抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1单链抗体(LMP1 scFv)/截断的鱼精蛋白截短体(truncatedprotamine,tP)融合基因,将其克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌中诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白。方法设计融合基因LMP1 scFv/tP,在LMP1 scFv/tP的5’和3’端设计EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点;在DNAWORKS程序指导下设计成22个相互互补的寡核苷酸序列,经PCR扩增获得融合基因LMP1 scFv/tP,再将目的基因片段亚克隆至pMD 18-Tsi mple载体中,经过酶切鉴定和测序验证。进一步将目的基因片段克隆至原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白并经SDS-PAGE和western blot验证。结果各寡核苷酸片段经PCR扩增后可见明确的产物带,将获得的LMP1 scFv/tP融合基因构建至原核表达载体pET32a,经IPTG诱导后成功表达目的蛋白。结论成功获得LMP1 scFv/tp融合基因,并在大肠杆菌中成功诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白,为该融合蛋白用于LMP1相关肿瘤的基因治疗奠定基础。

乳链菌表达hGM-CSF基因的拼装及其载体pNCSF构建

目的体外拼装适合在乳酸链球菌表达的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,hGM-CSF),并构建载体pNCSF。方法根据hGM-CSF的氨基酸序列及乳酸链球菌偏好的密码子,将hGM-CSF基因外显子的全长碱基序列用DNAWORKS程序设计成16条互补的寡核苷酸片段,并且分别在第1条和第16条寡核苷酸片段上分别设计PstⅠ和BamHⅠ酶切位点,将相同终浓度的寡核苷酸混合进行PCR反应,完成hGM-CSF基因拼接,得到目的基因片段,对寡核苷酸片段进行拼装和扩增,产物稀释后进一步纯化扩增,在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T,然后TA克隆于pGEMTeasy载体中,经酶切鉴定得到阳性克隆并经测序验证。然后亚克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000载体。结果通过PCR得到420左右目的DNA片段,获得了hGM-CSF和pNCSF阳性克隆,其DNA测序结果与设计序列完全一致。结论运用基因拼装及克隆技术成功拼装了hGM-CSF基因及构建了载体pNCSF,为乳酸链球菌表达重组hGM-CSF奠定了基础。