间苯三酚对泌尿平滑肌痉挛的调控作用机制

目的探讨间苯三酚对膀胱平滑肌痉挛的调控作用及其机制。方法体外水平上,采用膀胱肌条实验验证间苯三酚对不同药物刺激下膀胱痉挛的缓解作用;同时,RT-qPCR和Western blot检测间苯三酚解痉挛作用对膀胱组织中钙离子信号通路相关基因和蛋白的表达水平。转录组学分析间苯三酚在解除膀胱痉挛时对其他相关通路基因的影响,用RT-qPCR来验证相关基因的表达情况。结果间苯三酚能够缓解不同药物刺激引起的膀胱痉挛,且解痉作用随浓度增高而增强,组织细胞中Calponin 1和MYLK3的表达水平升高,PKCα表达水平降低。RT-qPCR检测结果显示间苯三酚作用时,小鼠膀胱组织中Gprc5bG、Ppp2r5a、Chpt1、Prkar2b、Abcd2、Rasd1基因的表达水平均明显降低,与RNA-seq的测序结果一致。结论间苯三酚具有缓解膀胱平滑肌痉挛的作用,其作用机制与钙离子信号通路相关。间苯三酚作用于膀胱平滑肌后,抑制了细胞外Ca^(2+)内流,结合于细胞中的钙调蛋白4Ca^(2+)CaM复合物减少,导致游离的Calponin 1含量升高。钙调蛋白使得MLCK活化程度下降,MLC磷酸化减少,抑制了Mg^(2+)-ATP酶的作用,肌球蛋白横桥与细肌丝肌动蛋白分离,肌肉舒张。同时,间苯三酚还抑制Rasd1基因的表达,提示其在作用于膀胱平滑肌时还可能与细胞周期、蛋白磷酸化、胆碱代谢、ATP合成以及肿瘤信号通路相关。

异种脱细胞膀胱黏膜下层支架的制备

目的构建一种具有良好组织相容性的脱细胞膀胱黏膜下层支架,探讨其作为生物材料的可行性。方法取健康猪膀胱依次置于不同浓度的叠氮钠溶液中。采用低渗处理、液氮反复冻融以及NaOH溶解等方法对猪膀胱进行脱细胞处理。通过组织学检测和紫外分光光度法确定脱细胞效率;细胞毒性试验、细胞黏附实验、以及皮下植入试验评价异种脱细胞膀胱黏膜下层支架的生物安全性。结果组织学观察结果显示,经脱细胞处理后支架内无细胞残留;与对照组比较,支架内残留的DNA含量显著降低。细胞毒性实验结果显示,支架浸提液对人膀胱平滑肌细胞的细胞活力无显著影响。细胞黏附实验结果显示,人膀胱平滑肌细胞能够在支架上贴附生长。皮下植入试验结果显示,支架植入后,炎症反应轻微,术后4周未见明显的炎性细胞浸润。结论经脱细胞处理获得的膀胱黏膜下支架具有良好的生物安全性,是一种安全的可植入材料。

急性尿潴留大鼠膀胱功能损害与组织结构改变的关系

目的研究急性尿潴留对大鼠膀胱功能和组织结构损害及其二者的关系。方法健康雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组(C组)及实验组。以2倍于正常膀胱容量生理盐水过度充盈2h建立急性尿潴留模型。实验组按充盈2h(E0组,n=5)、排空后1h(E1组,n=5)、排空后2h(E2组,n=5)、排空后3h(E3组,n=5)、排空后4h(E4组,n=5)分为5个时相点。测定膀胱容量及最大膀胱收缩压;观察膀胱形态学变化和组织细胞凋亡(TUNEL法)。结果急性尿潴留后膀胱容量及最大膀胱收缩压均降低。E0组膀胱组织表现为轻度炎症反应,细胞凋亡率轻度增加;膀胱排空后(E1-E4组)组织炎症反应明显,以黏膜及黏膜下组织渗出更明显,细胞凋亡率明显增加,明显高于C组和E0组(P<0.01),E1-E4各组无显著差异(P>0.05)。结论急性尿潴留后组织炎症渗出及细胞凋亡是膀胱功能改变的结构基础。

P2X嘌呤受体在大鼠膀胱ICCs细胞中的表达

目的探讨P2X嘌呤受体各亚型在大鼠膀胱ICCs细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)的表达及意义。方法制备SD大鼠膀胱组织铺片及冰冻切片,通过免疫荧光法检测大鼠膀胱组织内ICCs细胞分布情况,并进一步采用免疫荧光双标法检测ICCs细胞上P2X嘌呤受体各亚型的表达。结果SD大鼠膀胱中的ICCs细胞主要集中于黏膜下层、肌束边缘以及肌束间,并相互连接呈网络状分布。在7种P2X嘌呤受体亚型中,ICCs细胞上可检测到P2X2和P2X5两种亚型表达。结论大鼠膀胱ICCs细胞可表达P2X2和P2X5两种嘌呤受体亚型,从功能学上证实嘌呤能信号对ICCs细胞功能有影响。

急性尿潴留大鼠膀胱组织黄嘌呤氧化还原酶活性变化及其意义

目的探讨在急性尿潴留时大鼠膀胱组织黄嘌呤氧化还原酶(xanth ine oxidoreductase,XOD)活性变化的意义。方法以2倍于正常膀胱容量充盈膀胱2 h建立大鼠急性尿潴留模型。分别于充盈2 h及排空后1、2、3、4 h检测膀胱功能及膀胱组织中XOD活性及脂质过氧化产物丙二醛(m alond ialdehyde,MDA)含量;并观察超氧化物歧化酶(superox-ide d ismutase,SOD)对膀胱的保护作用。结果急性尿潴留期膀胱不稳定性收缩频率无显著改变,而排空后其不稳定性收缩频率增加。XOD活性在尿潴留期增高,排空后1 h活性降低,排空后2 h再次升高,随后逐渐降至正常。MDA在尿潴留期轻度增高,排空后早期明显增高,4 h后接近正常对照组水平。SOD治疗后逼尿肌不稳定性收缩频率、XOD活性及MDA含量与排空后2 h比较显著降低(P<0.01,0.05)。结论AUR时黄嘌呤氧化还原酶活性变化特征呈双相性改变。提示AUR后膀胱再灌注损害中内源性活性氧可能起诱导、促进炎症损害作用,外源活性氧在急性尿潴留排空后膀胱功能损害中可能起重要作用。

逼尿肌不稳定中钙激活钾/氯通道mRNA表达差异的实验研究

目的 探讨钙激活钾 氯通道在正常和不稳定逼尿肌组织中的mRNA表达变化。方法 雌性Wistar大鼠采用会阴部尿道结扎法制作成膀胱出口梗阻 (bladderoutletobstruction ,BOO)模型 ,经清醒状态膀胱测压确定逼尿肌不稳定(detrusorinstability ,DI)后 ,提取正常与DI逼尿肌组织mRNA ,以RTPCR方法研究组织中大电导钙激活钾通道 (bigconduc tancecalciumactivatedpotassiumchannel,Bkca)、小电导钙激活钾通道 (smallconductancecalciumactivatedpotassiumchannel,Skca)、钙激活氯通道 (calciumactivatedchloridechannel ,Clca)的mRNA表达 ,凝胶成像分析比较其差异性变化。结果 大鼠尿道梗阻后DI发生率 76 17%,膀胱容量及最大逼尿肌压显著增加 (P <0 0 1)。钙激活钾 氯通道在两组大鼠逼尿肌中均有表达 ,其中Bkca、Skca2、Skca3明显降低 ,而Clca明显升高。结论 钙激活钾 氯通道的表达改变可影响逼尿肌兴奋性的反馈调节 ,在逼尿肌不稳定的发病机制中有重要作用。

组蛋白乙酰化修饰在骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化中的作用

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)在平滑肌微环境中发生分化后平滑肌标志性基因乙酰化水平的变化,以及组蛋白乙酰化修饰在干细胞分化中的作用及机制。方法体外培养BMSCs和膀胱平滑肌细胞(BSMCs),选择同批次的第3代BMSCs,将与BSMCs共培养3d的BMSCs作为实验组,未经共培养的BMSCs作为对照组,采用RT-PCR检测两组BMSCs中平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)、钙调节蛋白(calponin)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)的表达丰度。采用条件为80%、20次、0.5 s、8个循环的超声破碎实验组及对照组BMSCs的DNA,以H3K9抗体结合特定乙酰化位点,采用免疫共沉淀技术(ChIP)沉淀BMSCs组蛋白乙酰化位点基因,接头PCR扩增所获基因,Real-time PCR检测所获基因中3种目的基因(α-SMA、Calponin、SM-MHC)的表达水平。结果 RT-PCR检测结果显示,实验组BMSCs中的平滑肌标志性基因(α-SMA、Calponin、SM-MHC)的mRNA表达水平较对照组明显增高[分别为0.176±0.003 vs. 0.070±0.002,0.079±0.002vs.0.051±0.003,0.091±0.004vs.0.034±0.001],差异均有统计学意义(P<0.01)。分光光度计检测ChIP后获得的DNA,结果表明H3K9乙酰化抗体沉淀所获DNA浓度高于Ig G抗体,且实验组高于对照组(P<0.05)。RealtimePCR分析BMSCs分化前后目的基因组蛋白H3K9乙酰化水平,结果显示,BMSCs分化后,实验组的平滑肌标志性基因α-SMA、calponin、SM-MHC的mRNA转录水平明显高于对照组[分别为9.26±5.03 vs. 1.01±0.05,2.33±0.65 vs.0.99±0.05,2.63±0.37vs.1.00±0.03],差异均有统计学意义(P>0.05)。结论在平滑肌微环境中,BSMCs特定位点H3K9乙酰化程度的增加可促进BMSCs向BSMCs的分化。

细胞间接触诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的实验研究

目的通过两种细胞的共培养探讨细胞间接触对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化的影响。方法分别采用密度梯度离心法和胶原酶消化法分离培养了骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和膀胱平滑肌细胞(bladder smooth muscle cells,BSMCs)。并对其进行了鉴定。在此基础上以单独培养的BMSCs和BSMCs分别作为阴性和阳性对照组,将获得的BMSCs和BSMCs在体外通过接触与非接触共培养作为实验组,对诱导后的BMSCs是否向平滑肌(smooth muscle cells,SMCs)分化通过免疫荧光和Western blot进行鉴定。结果对BMSCs进行流式细胞术检测结果显示CD90、CD44表达阳性率分别为99.78%,60.27%,CD45表达阴性,阳性率为0.21%。在BMSCs与BMSCs共同培养的实验中,Western blot结果显示:BMSCs本身表达少量calponin蛋白,接触组calponin的表达随培养时间的延长逐渐增多,非接触组无明显变化;免疫荧光显示:接触组在共培养第8天部分细胞抗calponin阳性,非接触组与诱导前无明显变化。结论初步认为BMSCs与BMSCs接触共同培养能诱导BMSCs向平滑肌分化。

系统护理干预对老年膀胱癌泌尿造口患者预后及生活质量的影响

目的研究系统护理干预对老年膀胱癌泌尿造口患者预后及生活质量的影响。方法选取54例膀胱癌患者,按照随机数表法将所有研究对象分为观察组和对照组,每组均为27例。对照组在术后行常规护理干预,观察组给予系统护理干预。比较2组在出院时及出院后1年生活质量、并发症及社会支持变化。结果出院后1年,观察组生活质量评分显著高于对照组,观察组症状评分显著低于对照组,观察组社会支持度显著优于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论系统护理干预可改善老年膀胱癌泌尿造口患者的心理、生理状况及体征症状,提高患者的总体健康状况,均有利于患者预后的改善,进而使得患者生活质量水平得以提高。

大鼠梗阻性低顺应性膀胱的组织结构改变

目的 观察大鼠梗阻性低顺应性膀胱细胞外基质成分的变化。方法 光镜、电镜观察大鼠梗阻性低顺应性膀胱壁上两种细胞外基质的主要成分胶原蛋白 ,弹性蛋白的改变。结果 与正常对照组相比 ,低顺应性膀胱组肌层内平滑肌束间的胶原蛋白浸润明显增多 ,而弹性蛋白则有所减少。结论 膀胱流出道梗阻后 ,膀胱壁上两种细胞外基质的主要成分胶原蛋白、弹性蛋白的沉积发生了变化 ,使膀胱纤维化 ,并最终可能对膀胱功能产生影响 ,使膀胱变为一种低容量 。

不稳定逼尿肌中ICCs细胞与逼尿肌收缩的关系

目的研究不稳定逼尿肌中ICCs细胞的数量、分布形式的变化及其功能改变对逼尿肌肌条收缩的影响,初步探讨ICCs细胞与逼尿肌不稳定的关系。方法近端尿道结扎法建立大鼠不稳定膀胱模型。分别于正常及不稳定膀胱的相同部位剪取3mm×4mm逼尿肌组织进行免疫荧光组织化学法检测c-kit阳性细胞的表达及分布情况;再于相同部位剪取2mm×7mm肌条进行收缩特性测定实验,并检测c-kit受体阻断剂对收缩的影响。结果不稳定逼尿肌中c-kit阳性细胞的数量较正常逼尿肌明显增多(P<0.05);正常逼尿肌中c-kit阳性细胞以散在分布为主,不稳定逼尿肌中以细胞网络形式存在;不稳定逼尿肌肌条的收缩频率和收缩幅度显著高于正常膀胱(P<0.05);加入Glevic后,不稳定逼尿肌肌条的收缩幅度显著减弱(P<0.05),频率无显著差异(P>0.05)。结论不稳定膀胱中ICCs细胞的数量明显增加,主要以细胞网络的形式存在;不稳定逼尿肌肌条收缩幅度和频率明显增高,但其收缩幅度可以被Glevic削弱,提示ICCs与逼尿肌不稳定的发生有密切关系。

大鼠BOO对膀胱逼尿肌生物力学特性的影响

目的 建立能较好模拟膀胱出口梗阻 (Bladderoutletobstruction ,BOO)的稳定的大鼠实验模型 ,探讨对逼尿肌收缩功能及顺应性的影响及其机制。方法 实验采用Wistar雌性大鼠近端尿道不全结扎法建立BOO模型 ;采用灌流肌槽 ,以胆碱类药物 (氯化氨基甲酰胆碱carbachol,非选择性M受体激动剂 )作为刺激因素 ,测定离体逼尿肌条的主动收缩功能。充盈期膀胱压力测定检测膀胱顺应性及低压充盈期末容积的变化。结果 2周后手术组膀胱出现典型的梗阻后表现。低压充盈期膀胱容积及膀胱湿重 (ml,g)均显著大于假手术组 (ml ,g)。出现逼尿肌不稳定 (Detrusorinstability ,DI)者收缩力逼尿肌条显著低于假手术组 ,逼尿肌稳定 (Detrusorstability ,DS)者梗阻 2周时及梗阻 4周时分别表现为高于和低于假手术组。梗阻后不稳定组大鼠逼尿肌呈低顺应性 ,而稳定组逼尿肌顺应性升高。结论 ①成年Wistar大鼠采用内径 1mm的近端尿道不全结扎法 ,建立的BOO实验动物模型具有方法简便、存活率高、稳定性好等特点 ,适合于膀胱出口梗阻的相关实验研究。②梗阻后逼尿肌的收缩性有两种改变 :不稳定组逼尿肌收缩性受损 ,稳定组逼尿肌收缩性出现双相性改变 ,即早期呈代偿性升高 ,继而降低。③梗阻后膀胱顺应性依逼尿肌稳定性而异 :逼尿肌不?

膀胱Cajal间质细胞对膀胱逼尿肌细胞兴奋调控的结构和功能特征的初步研究

目的探讨膀胱Cajal细胞(ICC细胞)在逼尿肌细胞兴奋调控中所起的作用。方法①透射电镜观察ICC细胞和逼尿肌细胞之间的超微结构联系;②以荧光光漂白恢复(FRAP)对相邻的ICC细胞和逼尿肌细胞进行检测,观察ICC细胞和相邻逼尿肌细胞之间的荧光强度的变化。结果①超微结构可见ICC细胞和逼尿肌细胞之间有缝隙连接;②对与单个ICC细胞相邻的逼尿肌细胞进行荧光漂白后,可发现逼尿肌细胞内的荧光强度有显著恢复(P<0.01),同时ICC细胞的荧光强度逐渐减弱,说明ICC细胞与逼尿肌细胞间有信号通讯的通路。结论①ICC细胞与逼尿肌细胞之间存在结构上联系;②ICC细胞可以将兴奋信号传递给周围的逼尿肌细胞。

荧光光漂白恢复技术在检测膀胱平滑肌细胞间通讯功能中的应用

目的 探讨膀胱平滑肌细胞间通讯的功能变化。方法 利用荧光光漂白恢复 (FRAP)技术检测膀胱平滑肌细胞GJIC功能。结果 在相同的时间内 ,对实验组和对照组膀胱平滑肌细胞漂白后平均荧光恢复率相比较 ,实验组显著高于对照组 (P <0 0 5 )。

ATP对正常及DI大鼠离体逼尿肌肌条自发性收缩的影响

目的初步探讨ATP对正常及DI大鼠离体逼尿肌肌条自发性收缩的影响。方法通过建立大鼠逼尿肌不稳定模型,采用离体逼尿肌肌条实验观察ATP对正常及DI大鼠逼尿肌收缩特性的影响。结果成功建立了稳定的大鼠DI模型,成功率76·67%。DI组离体逼尿肌肌条自发性收缩频率及收缩力明显高于对照组;ATP可以明显加快DI组逼尿肌肌条自发性收缩频率,而对收缩力无明显影响。结论ATP主要调节大鼠逼尿肌兴奋性方面,而在收缩力方面可能不起重要作用。

胆碱能受体在大鼠膀胱ICC样细胞的表达

目的探讨胆碱能受体(muscarinic acetylcholine receptors,M受体)各亚型在大鼠膀胱ICC样细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)的表达及意义。方法制备SD大鼠膀胱组织铺片,通过免疫荧法检测大鼠膀胱组织内ICC样细胞分布情况,并进一步采用免疫荧光双标法(c-kit抗体及M受体亚型抗体)检测膀胱ICC样细胞上M受体亚型的表达。结果在大鼠膀胱肌层及肌间发现膀胱ICC样细胞呈散在或者彼此连接的分布,M受体的5种亚型中,ICC样细胞上不表达M1、M4、M5受体亚型,表达M2和M3两种受体亚型。结论胆碱能神经可能通过激活膀胱ICC样细胞上胆碱能受体来调节膀胱功能。

豚鼠膀胱组织ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin43表达意义

目的探讨体外培养豚鼠膀胱组织ICCs细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)间隙连接蛋白Connexin43的表达。方法胶原酶消化法进行豚鼠膀胱组织ICCs细胞的原代培养,对照为原代培养膀胱平滑肌细胞,免疫荧光法进行两种细胞的特征性蛋白c-kit及平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)染色观察,免疫荧光法及Western blot法进行培养细胞Connexin43的检测。结果豚鼠膀胱ICCs细胞特征性蛋白c-kit染色阳性,SMA染色阴性。豚鼠膀胱ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin43表达水平较高,显著高于膀胱平滑肌细胞。结论豚鼠离体膀胱ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin43高表达可能是其信号传递的重要物质基础。

阴式子宫切除术后盆底肌功能锻炼对膀胱功能恢复的影响

目的探讨盆底肌功能锻炼对阴式子宫切除术后患者膀胱功能恢复的影响。方法收集2012年在我院行阴式子宫切术患者,其中2012年4月至2013年3月的96例为对照组,给予常规方法进行护理;2013年4月至2014年3月的106例为试验组,在常规护理的基础上由责任护士在术前后指导患者行盆底肌功能锻炼,比较两组患者第一次自主排尿后膀胱残余尿量、留置导尿管时间、导尿次数。结果试验组有100例患者自主排尿膀胱残余尿量≤100 ml,对照组有79例,差异有统计学意义(P<0.05);试验组留置尿管时间短于对照组,导尿次数少于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论指导患者进行盆底肌功能锻炼,能够促进术后膀胱功能恢复和提高护理工作质量,深化责任制整体护理内涵。

成年豚鼠膀胱ICCs细胞起搏电流的鉴定

目的确定成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)细胞是否具有起搏电流。方法采用胶原酶消化法,得到原代培养的成年豚鼠膀胱ICCs细胞。采用膜片钳技术,在全细胞记录模式下,记录其超级化激活的内向电流(hyperrepolarization-activated inward current,Ih)。结果原代培养的ICCs细胞和逼尿肌细胞的静息膜电位、膜电容存在明显差异;ICCs细胞可记录到起搏细胞特征电流Ih,而在逼尿肌细胞则记录不到。结论记录到成年豚鼠膀胱ICCs细胞具有起搏细胞的特征电流Ih,提示ICCs细胞在膀胱具有起搏作用。

大鼠膀胱平滑肌细胞自发性钙瞬变及其机制研究

目的观察大鼠离体活膀胱肌条铺片中平滑肌细胞自发性钙瞬变,并探讨平滑肌细胞自发性钙瞬变产生的机制。方法制作大鼠离体膀胱肌条铺片,生理液灌流保持肌条铺片活性。采用Fluo-4负载肌条铺片,激光共聚焦显微镜法观察其中平滑肌细胞自发性钙瞬变,并观察尼莫地平(Nimodipine)、2-氨基乙基二苯硼酸盐(2-aminoethoxydiphenylbo-rate,2-APB)、雷诺丁(Ryanodine)、毒胡萝卜素(Thapsigargin)对平滑肌细胞自发性钙瞬变的影响,探讨平滑肌细胞自发性钙瞬变产生的机制。结果可见大鼠离体活膀胱肌条铺片中平滑肌细胞产生节律性自发性钙瞬变,自发性钙瞬变幅度(F/F0)和频率分别为(2.20±0.13)和(10.31±2.74)次/min。L型钙离子通道阻断剂Nimodipine能完全抑制平滑肌细胞的自发性钙瞬变,2-APB、Ryanodine可将钙瞬变幅度分别降低至(1.98±0.14)、(1.81±0.11),而相应的钙瞬变频率则被减少为(8.18±1.97)(P<0.05,n=18)、(7.59±2.16)次/min(P<0.01,n=17)。Thapsigargin可抑制平滑肌自发性钙瞬变幅度至(1.76±0.11)(P<0.01,n=20),但对钙瞬变频率却无显著影响。结论细胞外钙离子通过L型钙离子通道入胞在平滑肌细胞自发性钙瞬变产生中起主要作用,而细胞内钙库中的钙释放入细胞质可能起辅助作用。