DBA/2小鼠感染不同疟原虫Th应答特点的比较研究

目的:探讨不同疟原虫感染DBA/2小鼠的免疫应答特点。方法:DBA/2小鼠经腹腔注射致死型约氏疟原虫(P.y17XL)和夏氏疟原虫(P.c AS)感染的红细胞,计数红细胞感染率;ELISA动态检测感染小鼠脾细胞培养上清中IFNγ-和IL-4水平;采用RT-PCR动态检测脾细胞中Th1和Th2型转录因子T-bet和GATA3 mRNA表达量。结果:两种疟原虫感染小鼠在感染早期T-bet mRNA表达量均明显增加,升高幅度明显高于GATA3,T-bet/GATA3比值明显高于感染前水平;IFNγ-明显升高后伴随IL-4分泌水平增加。但是,P.c AS感染小鼠IFNγ-水平明显高于P.y17XL感染小鼠,且随后的IL-4水平仅出现短暂升高,感染后前8天T-bet/GATA3比值未有明显下降趋势,原虫血症逐渐升高至小鼠全部死亡。相比,P.y17XL感染小鼠T-bet/GA-TA3比值在感染后第3天达峰值,随后缓慢下降但仍高于对照组,原虫血症得到控制至小鼠自愈。结论:抗疟保护性免疫不仅依赖于Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡,而且Th1/Th2型免疫应答的发生时相和效应强度可能影响着疟疾感染的最终结局。

香菇多糖对约氏疟原虫感染BALB/c小鼠Th1型应答的调节作用

目的探讨香菇多糖(Lentinan,Lent)对致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,Py17XL)感染BALB/c小鼠Th1型细胞免疫应答的调节效应。方法对Py17XL感染的BALB/c小鼠进行不同时间点的Lent预处理,动态观察用药后各组感染小鼠原虫血症水平和生存率;于感染后第0d、1d、3d和5d分别提取小鼠脾细胞,ELISA法检测脾细胞培养上清中IL-12、IFN-γ的分泌水平,Griess反应检测脾细胞培养上清中一氧化氮(NO)含量。结果与药物未处理组相比,感染前15d 1mg/kg Lent用药组显著降低感染小鼠的原虫血症水平,提高生存率;明显增强Th1型免疫应答中关键细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌水平,并提高NO含量。结论Lent预处理能够有效激发Py17XL感染的BALB/c小鼠Th1型细胞免疫应答的建立,提示调控免疫应答对于致死型约氏疟原虫感染早期免疫防御的重要性。

约氏疟原虫感染不同小鼠免疫分子的应答差异

目的探讨在约氏疟原虫感染过程中不同宿主的免疫应答差异。方法以约氏疟原虫(致死型)感染DBA/2和BALB/c小鼠,计算红细胞感染率;收集感染前和感染后1、3、6、9、12、15、20d小鼠血清,并无菌取出脾脏,培养脾细胞。应用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IFNγ和IL12水平,并通过Griess方法检测脾细胞培养上清中NO含量。结果DBA/2小鼠的原虫血症峰值水平明显低于BALB/c小鼠,并于感染后第20d左右自愈;BALB/c小鼠于原虫血症达到峰值水平后全部死亡;DBA/2小鼠的IFNγ和IL12水平于感染后1d即出现了有意义的升高并持续到第20d;BALB/c小鼠的IFNγ和IL12水平仅于感染后1d出现了有意义的升高;DBA/2小鼠NO的产生于感染后3d出现了有意义的升高,第6d达到峰值,而BALB/c小鼠的NO水平始终未见明显升高。结论DBA/2小鼠通过感染早期Th1细胞免疫应答的有效建立能够抑制原虫血症,IL12是启动并维持Th1细胞免疫应答的关键性细胞因子。

Toll样受体在约氏疟原虫感染早期树突状细胞应答中的作用地位

目的探讨致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii17XL,P.y17XL)感染早期,Toll样受体(Toll like receptor,TLR)在树突状细胞(dendritic cells,DCs)活化中的作用地位。方法用P.y17XL感染易感的BALB/c和抵抗的DBA/2小鼠,计数红细胞感染率;制备感染前和感染后第3d、5d小鼠脾细胞悬液,采用流式细胞分析技术检测两种小鼠感染不同时间脾细胞悬液中细胞内表达TLR9(Toll like receptor 9,TLR9)的DCs和细胞表面表达TLR4(Toll like receptor 4,TLR4)的DCs的百分含量。结果两种小鼠脾DCs细胞内TLR9的表达水平均于感染后第3d开始明显升高(P<0.01),在第5d达到最高水平(P<0.01),但两种小鼠相比无统计学意义。同时,两种小鼠DCs表面TLR4的表达水平均未见明显变化。结论在P.y17XL感染早期,TLR9可能是介导DCs活化的模式识别受体。

CD4^+CD25^+Foxp3^(hi)细胞在夏氏疟原虫感染DBA/2小鼠作用研究

利用调节性T细胞消除的致死型夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi chabaudi AS,P.c chabaudi AS)感染鼠疟模型,探讨DBA/2小鼠对P.c chabaudi AS感染易感性的原因。DBA/2小鼠对P.c chabaudi AS易感,伴随原虫血症增加CD4+CD25+Foxp3+细胞数量明显增加,且以CD4+CD25+Foxp3hi增加更为明显。原虫血症达峰值时CD4+CD25+Foxp3hi细胞数量亦达到峰值。相比,Treg消除鼠的原虫出现时间和疟血症峰值时间均明显延迟,且在疟血症达峰值前(5～8 d)原虫血症水平明显低于对照组。与之相应,CD4+CD25+Foxp3hi细胞数量明显处于低水平。同时,Treg消除鼠生存期明显延长。由此提示,P.c chabaudi AS感染导致Foxp3表达增加,扩增的CD4+CD25+Foxp3hi细胞有利于疟原虫复制和逃避宿主免疫应答,进而影响疟疾感染的进程和最终结局。

CD4^+CD25^+调节性T细胞在约氏疟原虫感染早期作用机制的实验研究

目的探讨CD4+CD25+调节性T细胞在约氏疟原虫感染早期的免疫调节机制。方法用抗CTLA-4mAb和抗CD25mAb分别与约氏疟原虫感染早期的小鼠脾细胞共同培养后,以ELISA法检测其培养上清的IL-10、TGF-β1及IFN-γ的含量。结果与抗CTLA-4mAb共同培养后,脾细胞上清中IL-10的水平明显降低,但TGF-β1和IFN-γ水平未出现有意义的变化;与抗-CD25mAb共同培养后,IL-10、TGF-β1和IFN-γ水平均未出现有意义的变化,但IL-10水平有一定的降低趋势。结论约氏疟原虫感染早期,IL-10可能是介导CD4+CD25+调节性T细胞参与免疫调节的关键性细胞因子,CD4+CD25+调节性T细胞可能通过CTLA-4发挥免疫抑制作用。

疟疾疗法抗肿瘤效应的实验观察

目的探讨疟疾疗法对肿瘤生长的拮抗效应及其作用机制。方法以S180瘤细胞接种BALB/c小鼠后第2天,实验组小鼠经腹腔感染约氏疟原虫。用吉姆萨薄血膜染色法确定小鼠的虫体血症水平,以ELISA试剂盒检测其脾细胞培养上清中IFN-γ含量,并于瘤细胞接种后第5天开始测量瘤肿块直径。结果疟原虫感染的红细胞于疟原虫接种后的第3天出现在感染小鼠的外周血中,其脾细胞产生IFN-γ的水平于感染后第4天出现显著升高;瘤细胞接种第7天后,疟疗实验组小鼠的瘤肿块直径明显小于单纯瘤细胞接种组。结论约氏疟原虫感染所致的疟疗效应对S180瘤细胞的生长具有一定抑制作用。

青蒿琥酯治疗对约氏疟原虫感染小鼠特异性免疫建立的影响

目的阐明青蒿琥酯治疗对约氏疟原虫感染小鼠特异性免疫建立的影响。方法DBA/2和BALB/c小鼠经腹腔感染约氏疟原虫后均分为三组:感染后未治疗组、感染第3天和第6天青蒿琥酯治疗组。初次感染痊愈后30天用同种疟原虫再次感染,再感染疟原虫清除后30天进行第三次感染,观察每次感染后小鼠原虫血症水平和对重复感染的特异性抵抗能力。结果未治疗的自然自愈组和不同时间治疗组的DBA/2小鼠,其再次感染的感染率、原虫血症水平基本相同,第三次感染均未见疟原虫感染的红细胞;除非治疗组BALB/c小鼠于初次感染早期死亡外,不同时间治疗组的BALB/c小鼠再次感染的感染率与虫体血症水平、第三次感染情况与各组DBA/2小鼠也无差异。结论对于约氏疟原虫初次感染免疫应答能力不同的DBA/2和BALB/c小鼠,青蒿琥酯根治性治疗不影响其特异性免疫的建立和免疫记忆性的维持。

左旋精氨酸上调约氏疟原虫感染DBA/2小鼠的抗体应答效应

探讨左旋精氨酸(L-Arginine,L-Arg)对约氏疟原虫(Plasmodium yoelii17XL,P.y17XL)感染DBA/2小鼠体液免疫应答的调节效应。于P.y17XL感染前7 d,连续每日给予DBA/2小鼠L-Arg(1.5 g/kg体重)灌胃预处理,动态观察各组感染小鼠原虫血症水平和生存率;于感染后第0、8和10天分别提取小鼠脾细胞,流式细胞术检测DBA/2小鼠浆细胞分泌IgG1和IgG2a的水平。与NC组比较,L-Arg能够显著降低感染小鼠的原虫血症水平,自愈时间提前。感染后8 d和10 d,L-Arg组CD138+B220+IgG1+细胞数量出现有意义的增加,感染后10 d,L-Arg组CD138+B220+IgG2a+细胞数量明显升高。L-Arg处理可诱导DBA/2小鼠建立更加有效的抗体免疫应答,明显加速DBA/2感染小鼠清除疟原虫。

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对啮齿类疟原虫感染过程及结局的影响

目的探讨CD4+CD25+调节性T细胞数量在约氏疟原虫(致死型)和夏氏疟原虫混合感染小鼠免疫应答中的动态变化。方法DBA/2和BALB/c小鼠分别经腹腔注射致死型约氏疟原虫(P.y17XL)、夏氏疟原虫(P.cAS)和P.y17XL+P.cAS(1∶1)混合感染的红细胞,计数红细胞感染率;采用流式细胞术动态检测脾细胞中Tregs细胞数量的变化。结果P.y17XL+P.cAS感染的DBA/2小鼠于感染后18d自愈;而BALB/c小鼠于感染过程中虽然出现死亡(8d),但与P.y17XL感染小鼠(5d)相比,死亡时间明显延迟;P.y17XL和P.y17XL+P.cAS感染的DBA/2鼠于感染后第5d CD4+CD25+调节性T细胞数量均达峰值,随后缓慢下降,相比P.cAS感染的DBA/2鼠于感染后第10d达峰值,是其它两种同天感染鼠的3倍和2倍,且小鼠全部死亡;而P.y17XL和P.y17XL+P.cAS感染的BALB/c小鼠CD4+CD25+调节性T细胞数量于感染后均迅速升高,分别于感染后第5d和第8d达30%左右,小鼠全部死亡,相比P.cAS感染的BALB/c小鼠CD4+CD25+调节性T细胞数量于感染后缓慢升高,于感染后第5d达14%,随后开始下降。结论①P.y17XL+P.cAS混合感染DBA/2鼠后CD4+CD25+调节性T细胞数量的动态变化与P.y17XL单独感染表现出完全相同的模式;BALB/c鼠:CD4+CD25+调节性T细胞数量的动态变化与P.y17XL单独感染也表现出完全相同的模式,但变化的时间明显被滞后;②CD4+CD25+调节性T细胞的异常升高与感染结局密切相关。

特异性IgG抗体在同源与异种疟原虫再感染中的作用研究

目的探讨特异性IgG抗体在同源和异种疟原虫再感染过程中的作用。方法DBA/2小鼠经腹腔感染致死型约氏疟原虫(Py17XL)60d后,采用等量Py17XL、Py17XNL、Pynigeriensis或PbANKA分别再次攻击,计数红细胞感染率;采用ELISA方法动态检测脾细胞培养上清中IFN-γ及其血清中特异性IgG抗体水平的变化。结果Py17XNL和Pynigeriensis再感染小鼠出现一过性低水平的原虫血症;再感染后第4d脾细胞培养上清中IFN-γ水平与正常小鼠相比无显著性差异(P>0.05),而血清中特异性IgG抗体水平明显升高(P<0.01),小鼠全部存活。相比,PbANKA再感染小鼠出现高水平的原虫血症,与其初次感染水平相近,再感染后第4d脾细胞培养上清中IFN-γ水平出现明显升高(P<0.01),而血清中特异性的IgG抗体水平却无明显变化,与正常小鼠水平接近,小鼠全部死亡。结论特异性IgG抗体可在宿主抗同源疟原虫再感染中发挥着重要作用,而对异种疟原虫再感染无保护性。

致死型夏氏疟原虫感染BALB/c小鼠CD4^+ CD25^+ Foxp3^+调节性T细胞在Th2免疫应答极化中的作用研究

为探讨CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞)在疟疾感染过程中对Th2极化的调控作用,利用Treg细胞消除的致死型夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi chabaudi AS,P.c chabaudi AS)感染鼠疟模型进行研究。结果显示,对照组小鼠在感染后8 d原虫血症达到峰值40.5%,随后迅速下降,于感染后18 d小鼠自愈。相比,Treg细胞消除组于感染后10 d,原虫血症水平迅速上升至32%,随后小鼠相继死亡。在感染后8～10 d,Treg细胞消除小鼠脾脏CD4+ CD25+ Foxp3+细胞占CD4+细胞百分比含量明显低于对照组。同时,血清疟原虫特异性抗体IgG1和IgG2a水平均明显降低。结果提示,P.c chabaudi AS感染中CD4+ CD25+ Foxp3+细胞参与调控Th2型免疫应答的极化,进而干预疟原虫清除。

斑须按蚊头及唾液腺疟原虫出丝诱导物质的比较

目的 比较斑须按蚊头与唾液腺中疟原虫雄配子体出丝诱导物质的相对含量。方法 应用体外雄配子体出丝分析方法 ,分别检测斑须按蚊头及唾液腺匀浆上清在单位器官和单位蛋白浓度条件下的出丝诱导活性。结果 斑须按蚊头和唾液腺含有疟原虫雄配子体出丝诱导物质 ;在相同单位器官浓度条件下 ,斑须按蚊头部匀浆上清的雄配子体出丝诱导活性高于唾液腺上清 :在相同单位蛋白浓度条件下 ,斑须按蚊唾液腺匀浆上清的出丝诱导活性高于头部上清。结论 雌性斑须按蚊唾液腺含有较高浓度的疟原虫雄配子体出丝诱导物质 ,并在蚊胃腔内疟原虫雄配子发生过程中发挥重要的生理作用。

CD4^+CD25^+T细胞在夏氏疟原虫感染鼠中的应答差异

为探讨CD4+CD25+调节性T细胞(Treg细胞)在夏氏疟原虫感染过程中的活化特点及其与疾病进展的相关性,用夏氏疟原虫分别感染BALB/c和DBA/2小鼠,Giemsa染色制备薄血膜,镜检计数红细胞感染率;以流式细胞术检测脾细胞悬液中Treg细胞百分含量;ELISA测定脾细胞培养上清IFN-γ水平。BALB/c小鼠原虫血症于感染后第8d达到峰值34.4%后迅速下降,于感染后第15d左右小鼠自愈;其IFN-γ水平和Treg细胞百分含量均在感染后第5d明显增加后开始下降(P<0.01);DBA/2小鼠原虫血症于感染后第9～11d一直维持在峰值38%左右,并在感染后约第10d小鼠死亡;其IFN-γ水平在感染后第3d明显升高后迅速回落(P<0.01),Treg细胞百分含量在感染后的前8d平稳升高,但于感染后第8～11d出现骤然上升。结果提示,CD4+CD25+调节性T细胞数量异常变化与宿主感染结局呈密切相关性。

CD_4^+T细胞在约氏疟原虫抵抗型小鼠模型中的作用与地位

目的探讨抵抗型小鼠CD4+T细胞在疟原虫感染过程中的作用与地位。方法以约氏疟原虫感染DBA/2小鼠,于自愈后30 d、60 d和90 d,分别用同种疟原虫进行再次感染。以吉姆萨薄血膜染色法观察小鼠虫体血症水平,采用ELISA法和Griess反应分别检测初次及再感染后第3 d和第10 d脾细胞培养上清中IFN-γ、NO水平和血清中特异性IgG水平,并以流式细胞仪检测小鼠脾细胞中CD4+T细胞百分率。结果初次感染后第3 d,疟原虫感染的红细胞出现于小鼠的外周血中,且其脾细胞可产生高水平的IFN-γ和NO;感染后10 d,IFN-γ和NO回落至感染前水平,CD4+T细胞百分率有所下降,但特异性IgG出现了有意义的升高。与初次感染相比,再感染过程中仅出现一过性低水平的虫体血症,再感染后第3 d和第10d的CD4+T细胞百分率和IFN-γ及NO水平均未出现有意义的变化,而高水平IgG一直持续存在。结论与再次感染相比,约氏疟原虫感染的抵抗型小鼠在初次感染早期可建立更为显著的CD4+Th1型细胞反应。

特异性IgG抗体作为宿主抗约氏疟原虫再感染关键效应分子的研究

目的探讨再感染早期宿主保护性免疫应答的相关机制。方法采用致死型约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii 17XL,Py17XL)感染抵抗型DBA/2小鼠,待全部小鼠自愈后用同种疟原虫株再次攻击。吉姆萨薄血膜染色法观察小鼠原虫血症水平;被动转移实验评估免疫血清的保护性作用;流式细胞仪检测脾中T、B细胞亚群动态变化。结果2/3小鼠能够完全抵御同种疟原虫再感染,仅1/3小鼠出现一过性低水平原虫血症,且于再感染后第8d自愈;免疫血清显著抑制初次感染小鼠原虫血症水平并延长其生存期;与初次感染相比,再感染早期脾CD4+T细胞、B220+和B220lowCD138+(浆细胞)亚群数目显著增加。结论特异性IgG抗体在宿主抗再感染免疫中发挥重要作用,记忆性T、B细胞可能为宿主保护性免疫应答的关键参与者。

维生素E对约氏疟原虫感染BALB/c小鼠早期免疫应答的抑制效应

目的:探讨维生素E(Vitamin E,VE)对致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,P.y17XL)感染BALB/c小鼠的免疫调节效应。方法:6～8周、雌性BALB/c小鼠,随机分为实验组和对照组,经腹腔接种1×106P.y17XL寄生的红细胞,实验组于感染前10天口服给予VE预处理。动态观察两组小鼠的原虫血症水平;流式细胞术检测感染后第0、3和5天脾树突状细胞(Dendritic cells,DCs)亚群和Toll样受体9(Toll like receptor,TLR9)表达水平、以及巨噬细胞和活化T细胞的表达数量。结果:(1)与正常感染组相比较,补充VE加重感染小鼠的原虫血症水平,死亡率于感染后第6天达到70%,而正常感染组在感染后第6天死亡率只有30%;(2)与正常感染组相比,在每一检测点,VE处理组小鼠脾脏DCs亚群表达水平显著降低;同时,F4/80+巨噬细胞数量明显低于对照组,在感染后第5天,VE处理组小鼠脾脏T细胞活化水平显著降低。结论:在P.y17XL感染早期,VE预处理可通过抑制DCs的成熟和分化,从而加剧P.y17XL感染BALB/c小鼠的感染进程。

脂多糖对约氏疟原虫感染DBA/2小鼠感染早期的免疫调节作用

目的本文主要探讨脂多糖(LPS)在致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17×L,Pyl7×L)感染早期的调节作用。方法 6～8w、雌性DBA/2小鼠,随机分为实验组和对照组,经腹腔接种1×106 Pyl7XL寄生的红细胞。实验组于感染后d2静脉给予LPS(25μg/只)。动态观察两组小鼠的原虫血症水平,小鼠脾脏树突亚群及其表面TLR4和活化T细胞的表达水平。结果 (1)两组小鼠于感染后约d15均自愈,LPS处理组小鼠的原虫血症水平在感染后d5-8显著低于对照组;(2)与对照组相比,在感染后d3和d5,LPS处理组小鼠脾脏DCs亚群表达水平显著升高,在感染后d3,TLR4表达水平显著升高。在感染后d5,LPS处理组小鼠脾脏细胞培养初始活化T表达水平显著升高。结论在P.y17×L感染早期,LPS可通过激活TLR4强化DC成熟进一步强化Th1免疫应答反应,降低原虫血症,这将为疫苗的开发提供新的靶点。

抗疟治疗对宿主保护性免疫影响的实验研究

目的探讨药物治疗对宿主保护性免疫建立的影响。方法用不同剂量氯喹或青蒿琥酯治疗约氏疟原虫(非致死型)感染的BALB/c小鼠。待自愈组清除疟原虫后30d,用约氏疟原虫(非致死型和致死型)以及伯氏疟原虫再次感染。以吉姆萨薄血膜染色法观察小鼠虫体血症水平,采用ELISA法检测脾细胞培养上清中IFN-γ水平和血清中特异性抗体水平。结果自愈组和各治疗组小鼠于初次感染早期均产生高水平IFN-γ,随之抗约氏疟原虫(非致死型)特异性IgG抗体水平显著升高,且无明显差异。对约氏疟原虫(非致死型和致死型)再次攻击小鼠均呈完全抵抗,少数出现低水平一过性虫体血症。而异种疟原虫攻击时小鼠全部感染并死亡。结论氯喹或青蒿琥酯不同剂量治疗不影响小鼠保护性免疫的建立和免疫记忆的维持,特异性IgG抗体是宿主抵御再感染主要的免疫效应分子。

Tim-1分子在约氏疟原虫感染模型中的表达分析

Tim-1分子表达在T细胞和调节性B细胞表面,具有促进Th2应答的作用。为探讨Tim-1分子在抗疟疾免疫应答中的作用,利用致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)感染鼠疟模型研究了Tim-1分子表达与小鼠感染结局和免疫应答模式的关系。结果显示,BALB/c小鼠对P.yoelii易感,在感染后6～7 d全部死亡,感染后第3、5天脾内细胞因子IFN-γmRNA水平明显低于对P.yoelii抵抗的DBA2小鼠,而脾IL-10 mRNA水平显著高于DBA2小鼠。BALB/c小鼠脾内Tim-1+T、B细胞百分比在感染后第3、5天显著升高,而DBA2小鼠感染前后脾内Tim-1+T、B细胞百分比没有显著变化。结果提示,Tim-1分子参与抗P.yoelii免疫应答的调节,可能与易感鼠产生高水平Th2型细胞因子有关。