戊地昔布对人胃癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨选择性环氧化酶 2 (COX 2 )抑制剂戊地昔布对人胃癌BGC 82 3细胞的作用及其作用机制。方法 用MTT法检测戊地昔布对人胃癌BGC 82 3细胞生长的作用 ,用流氏细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布 ,用激光共聚焦显微镜、透射电镜和DNA片段进一步检测细胞凋亡 ,用乳酸脱氢酶 (LDH)试剂盒测定BGC 82 3细胞的LDH含量。结果 戊地昔布 (2 5～ 4 0 0 μmol·L-1 )可时间和浓度依赖性抑制人胃癌BGC 82 3细胞的生长 ,作用 72h后 ,对细胞生长抑制率可达 2 4 0 %～ 92 0 % ,凋亡率由 (2 6± 0 7) %增加到 (7 6±1 5 ) %～ (1 6 5± 1 5 ) %。 1 0 0～ 4 0 0 μmol·L-1 也降低增殖指数 ,减少细胞周期S期细胞 ,增加G0 /G1 期细胞。随浓度增加 ,戊地昔布引起的LDH释放率有增加趋势 ,但只有 4 0 0μmol·L-1 戊地昔布可显著增加LDH释放率。结论 戊地昔布可通过诱导凋亡和细胞周期停滞而抑制人胃癌BGC 82 3细胞生长 ,4 0 0 μmol·L-1 戊地昔布抑制BGC 82

鬼臼毒素-固体脂质纳米粒的皮肤毒理学实验

目的:考察鬼臼毒素-固体脂质纳米粒经皮肤用药的安全性。方法:实验于2005-12/2006-11在南方医科大学药学部实验室完成。选择Wistar大鼠140只,Fmmu豚鼠78只。采用改良的乳化蒸发-低温固化法制备5,50mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒及空白固体脂质纳米粒。①取豚鼠48只,按随机数字表法分成5,50mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒及空白固体脂质纳米粒完整皮肤组和破损皮肤组,每组4只,分别进行单次和多次给药皮肤刺激试验。单次给药方法:豚鼠背部两侧对称脱毛后用手术刀片作#字划痕,以渗血为度。采用同体左右侧自身对照法,左侧为受试区,分别取5,50mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒及空白固体脂质纳米粒混悬液0.1mL均匀涂布于受试区,右侧为空白对照区,再以自制单层塑料薄膜和双层纱布封包受试区。分别于去除敷料和清洗受试物后1,24,48h观察涂药部位有无红斑和水肿等情况,以及上述变化的恢复情况与时间。多次给药方法:皮肤处理方法、观察指标及评价指标同上,每日给药1次,连续给药14d。②取大鼠140只,按随机数字表法分成5,50mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒及空白固体脂质纳米粒完整皮肤组和破损皮肤组、正常对照组,每组10只,分别进行急性和长期皮肤毒性试验。急性毒性试验方法:脱毛后,分别取5,50mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒及空白固体脂质纳米粒混悬液1mL均匀涂布于受试区,连续观察14d,每日观察大鼠体质量、进食量、皮肤、呼吸、体态、眼、中枢神经系统、四肢活动、粪便性状及死亡情况。长期毒性实验方法:皮肤处理方法及观察指标同上,每日给药1次,药量均为0.1mL,连续给药30d,末次给药后24h麻醉后处死动物,取血3￣4mL进行血液学、血液生化学及皮肤病理检查。③取豚鼠30只,按随机数字表法分成50mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒组、阴性对照组及阳性对照组,每组10只,进行皮肤变态反应试验。方法:脱毛后,3组左侧脱毛区分别涂50mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒混悬液、空白固体脂质纳米粒混悬液及10g/L二四二硝基氯苯0.1mL,涂药后以自制单层塑料薄膜和双层纱布封包受试区,6h后去除敷料和清洗受试物。第7天和第14天,以同样方法各重复1次,共3次。于末次给受试物致敏后14d,将受试物0.1mL涂于豚鼠背部右侧脱毛区,6h后去掉受试物,即刻观察皮肤变态反应情况,之后于24,48,72h再次观察皮肤反应。结果:纳入大鼠140只,豚鼠78只,均进入结果分析。①单次和多次给予鬼臼毒素-固体脂质纳米粒对豚鼠完整和破损皮肤均无刺激作用。②单次大剂量给予5mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒及空白固体脂质纳米粒,未见对大鼠有急性毒性反应。给予50mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒组大鼠分别于给药后的前3,8d出现体质量减轻、食欲下降等全身中毒症状,尤以皮肤破损组表现较明显,以后逐渐恢复;每日小剂量给予5mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒及空白固体脂质纳米粒,未见对大鼠有明显长期毒性反应。③给予50mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒组大鼠于给药后的18￣25d,均出现轻度的皮肤红斑、水肿、糜烂和结痂等炎症反应,于停药后1周内消退,皮肤组织病理学检查可见以表皮为主的急性炎症反应;鬼臼毒素-固体脂质纳米粒对豚鼠皮肤无致敏性。结论:在有效观察时间和一定质量浓度范围内,鬼臼毒素-固体脂质纳米粒对豚鼠皮肤无刺激性及致敏性,对破损皮肤大鼠应用50mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒大剂量时易出现全身急性中毒反应而完整皮肤及5mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒应用则较安全,小剂量长期应用鬼臼毒素-固体脂质纳米粒对大鼠比较安全无系统吸收毒性,但应用50mg/L鬼臼毒素-固体脂质纳米粒时可以出现轻度的皮肤炎症反应。

高糖诱导胰岛细胞凋亡机制的研究

目的:探索不同浓度葡萄糖引起胰岛细胞凋亡的机制. 方法:用胶原酶P消化Ficol1400纯化的成年SD大鼠胰岛细胞,经RPMI1640培养7天后铺成单层,分别设立对照组和不同浓度的葡萄糖组,用放免法测定加葡萄糖后1、3、5、7、9和11天胰岛素浓度.用流式细胞术测定加处理因素后11天的胰岛细胞凋亡率和免疫组化法测定bax及bcl-2蛋白的表达.另取单层培养的胰岛细胞,亦设立对照组和加入不同浓度甘露醇组,培养11天后,用免疫组化法测定bax和bcl-2蛋白的表达,流式细胞术测定胰岛细胞凋亡率. 结果:①葡萄糖为11.1mmol/L时,胰岛素浓度开始升高;当葡萄糖升至22.2mmol/L时达高峰,且随时间延长而下降.②葡萄糖为11.1和22.2mmol/L时,胰岛细胞凋亡率最高, 5.5mmol/L组与对照组的凋亡率差异无显著性意义.甘露醇组胰岛细胞的bax及bcl-2蛋白表达与对照组比较无显著差异,胰岛细胞凋亡率与对照组比较亦无著著差异.③葡萄糖在11.1～22.2mmol/L时,bax蛋白表达阳性,bcl-2蛋白表达阴性,葡萄糖在33.3mmol/L时,bax和bcl-2蛋白的表达匀为阴性,5.5mmol/L组bax和bcl-2蛋白的表达与对照组无显著差异. 结论:高血糖(葡萄糖为11.1和22.2mmol/L)可引起胰岛细胞凋亡和胰岛素释放增加,当葡萄糖浓度升至33.3mmol/L时,胰岛细胞凋亡率开始下降,胰岛素释放也减少.表明高渗状态与高血糖诱导的胰岛细胞凋亡无关.

几丁糖对高糖腹透液刺激大鼠腹膜间皮细胞TGF-β1表达的影响

目的探讨高糖腹透液(4.25%)对大鼠二代腹膜间皮细胞TGF-β1表达的影响及几丁糖(chitosan)的干预作用。方法取第2代鼠腹膜间皮细胞(rat peritoneal mesothelial cells,RPMC)(经细胞形态和免疫组化鉴定),随机分为4组(n=4),A组即对照组:DMEM/F12培养基培养;B组:DMEM/F12培养基中加入4.25%葡萄糖透析液;C组:DMEM/F12培养基中加入4.25%葡萄糖透析液+几丁糖1.2mg/L;D组:DMEM/F12培养基中加入4.25%葡萄糖透析液+几丁糖0.4mg/L。培养24h收集细胞提取RNA,48h收集细胞提取蛋白,RT-PCR检测腹膜间皮细胞TGF-β1mRNA的表达。Western印迹检测TGF-β1的蛋白表达。结果①RPMC经高糖腹透液(4.25%)刺激后,TGF-β1mRNA和蛋白的表达均上升,与0h比较,TGF-β1mRNA和蛋白的表达分别于24、48h时达到高峰,A、B两组比较差异有统计学意义(P<0.05);②24h时,几丁糖使TGF-β1mRNA的表达下降明显(P<0.05),B组分别为A组的2.51倍、C组的2.13倍、D组的1.68倍,D组为C组的1.26倍且抑制程度与几丁糖浓度呈正相关(r=0.948,P<0.01)。48h时,几丁糖使TGF-β1的蛋白水平下降明显,B组分别为A组的1.85倍、C组的1.52倍、D组的1.24倍,D组为C组的1.23倍。C、D两组分别与B组比较差异有统计学意义(P<0.05),且抑制程度与几丁糖浓度呈正相关(r=0.831,P<0.05)。结论①高糖腹透液可刺激RPMCTGF-β1mRNA和蛋白表达上调;②几丁糖可抑制腹膜纤维化的中枢性因子TGF-β1表达的活性。

外源性Nurr1基因过表达增强SK-N-SH细胞对神经毒素6-OHDA敏感性的研究

目的 通过比较自身不表达Nurrl基因的人神经母细胞瘤细胞SK—N—SH和过表达外源性Null基因的SK—N—SH／Nurrl细胞对神经毒素6-羟多巴胺（6-OHDA）损伤的敏感程度，探讨Null基因与6一OHDA引起的多巴胺（DA）能神经元特异性损伤的相关性。方法①绘制SK—N—SH细胞及SK—N—SH／Nurrl细胞的生长曲线，比较外源性Null基因过表达对细胞增殖率的影响。②用不同浓度的6-OHDA（5—100μmol·L^-1）分别作用两株细胞1—24h，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，MTT测定法比较两株细胞的存活率。③用75μmol·L^-1的6-OHDA作用12h，经Hoechst33342染色，荧光显微镜观察细胞核形态，比较两株细胞的凋亡情况。结果①生长曲线结果显示，SK—N—SH／Null细胞增殖数目低于SK—N—SH细胞一②MTT结果显示，6-OHDA对两株细胞的存活均有抑制作用，但SK—N—SH／Null细胞存活率下降更为明显。③Hoechst33342染色结果显示，用75μmol·L^-1的6-OHDA作用12h后SK—N—SH细胞核没有出现明显的凋亡形态改变，而部分SK—N—SH／Null细胞的细胞核出现了染色质凝聚、碎裂等凋亡形态改变，比例约为22％-24％。结论外源性Null基因过表达抑制SK—N—SH细胞增殖，增强SK—N—SH细胞对6-OHDA的敏感性并有可能促进6-OHDA诱导的细胞凋亡。Null基因可能作为易感因子参与多巴胺能神经元的特异性损伤。

真皮干细胞与皮肤衰老关系的研究进展

真皮干细胞(dermalstemcells,DSC)是近年在真皮中分离出的一类成体干细胞,在一定条件下可分化为成纤维细胞、骨细胞、脂肪细胞等。其研究主要集中在皮肤组织工程、创伤修复等方面,但有关其在皮肤衰老中的作用还鲜见报道。皮肤衰老主要与真皮成纤维细胞减少、衰老及其生物学特性改变有关,而DSC在一定条件下通过表达细胞因子能激活或分化为成纤维细胞,进而刺激胶原、弹力蛋白等分泌和合成,增强细胞外基质,促进消除皱纹和增加皮肤弹性,为抗皮肤衰老提供新的途径。

肝细胞生长因子基因转染脂肪细胞对移植组织工程脂肪存活的影响

背景:在脂肪组织工程的研究中,若将种子细胞与支架材料复合后移植,则此组织工程脂肪将可替代颗粒脂肪。肝细胞生长因子可以促进血管生成、减少纤维组织增生。目的:观察肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞对大鼠组织工程脂肪移植存活的影响。设计、时间及地点:随机区组设计的动物实验,于2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院医学科学实验中心完成。材料:纳入Wistar大鼠用于分离、培养骨髓间充质干细胞及植入细胞-支架复合物。方法:①分离培养雄性大鼠骨髓间充质干细胞,诱导成脂,携带绿色荧光蛋白基因及肝细胞生长因子基因的重组腺病毒毒株分别转染脂肪细胞,流式细胞仪测定转染效率,应用酶联免疫吸附试验法测定培养上清中肝细胞生长因子的表达,将脂肪细胞接种于聚乳酸聚乙醇酸共聚物支架。②将75只Wistar雌性大鼠按随机数字表法分为3组:脂肪细胞组、Ad-肝细胞生长因子转染组及Ad-绿色荧光蛋白转染组分别将脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染肝细胞生长因子基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染绿色荧光蛋白基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物移植于大鼠腿部肌肉之间。主要观察指标:移植后3,7,14,28,60d,每组各取5只大鼠麻醉后处死,取出移植物。电镜观察;并行苏木精-伊红、油红O、Masson’s染色,观察病理改变;同时用免疫组织化学法检测组织中肝细胞生长因子表达,观察并计数血管生成。结果:①骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞胞浆内富含丰富的脂滴,重组腺病毒感染复数=100时,携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒株转染脂肪细胞效率可达64.39%。②移植3,7,14d时,Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中肝细胞生长因子的表达高于其他组(P<0.05),且3d达到高峰。③移植3,7,14,28,60d时,Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中血管生成高于其他组(P<0.05),且7d时血管增加的幅度最大。④移植28,60d时,Ad-肝细胞生长因子转染组坏死程度均小于其他组,电镜下脂肪细胞也多于其他组。结论:携带肝细胞生长因子基因的脂肪细胞在移植物中能够表达肝细胞生长因子,促进移植组织工程脂肪血管生成,进而促进移植组织的成活。

完全去神经大鼠皮肤愈合过程中神经纤维再生和降钙素基因相关肽的变化

目的:观察完全去神经对大鼠皮肤伤口愈合的影响及愈合过程中神经纤维再生和降钙素基因相关肽的变化情况,探讨神经纤维再生和降钙素基因相关肽与伤口愈合的关系。方法:实验于2006-02在北京大学人民医院中心实验室完成。雌性Wistar大鼠32只,体质量250～300g。切断所有大鼠右下肢的坐骨神经和股神经,然后分别制造1cm的圆形皮肤缺损作为去神经组,在大鼠左下肢相应部位制造同样皮肤缺损作为对照组,于伤后1,3,7,14d每个时间点随机处死8只大鼠,用3M贴膜覆盖于伤口,然后沿切口周围1cm切取伤口组织,观察伤口愈合情况,组织化学染色观察神经丝蛋白和降钙素基因相关肽的变化。结果:纳入大鼠32只,均进入结果分析,伤口无感染。①两组大鼠伤后7d的伤口面积比伤后1d均明显缩小[去神经组:(0.195±0.053),(0.687±0.053)cm2;对照组:(0.131±0.041),(0.562±0.088)cm2]。与对照组相比,去神经组伤后3d大鼠的伤口面积无明显变化[(0.366±0.031),(0.408±0.079)cm2,P>0.05]。②去神经组伤口的神经丝蛋白和降钙素基因相关肽阳性染色在伤后第1,3,7,14天均明显少于对照组。结论:完全去神经后皮肤伤口愈合缓慢,而伤口内的神经纤维再生缓慢和降钙素基因相关肽的减少与皮肤伤口愈合缓慢有着密切关系。

足叶乙甙诱导HL-60细胞凋亡及其bcl-2基因表达

研究HL-60细胞在足叶乙甙（Vp16）诱导的细胞凋亡中bcl－2基因表达，以说明药物致调亡的分子机制。方法：采用细胞存活率，形态改变，DNA梯形片段分析和原位缺口标记法，分析药物引起的细胞凋亡，以细胞原位杂交和免疫组化分析bcl－2mRNA及其蛋白的表达水平。结果：Vp16有效地诱导HL60细胞凋亡，12h形成DNA缺口，16h出现DNA梯形片段，24h形成调亡小体，48hDNA完全降解；细胞凋亡时其bcl－2mRNA和蛋白水平都较处理前明显降低。结论:bcl－2基因表达的下调在Vp16诱导的HL-60细胞调亡中起一定作用。

腹腔内脏脂肪在肾细胞癌生物侵袭性及预后评估中的研究

肥胖与肾细胞癌的发生发展密切相关。高腹腔内脏脂肪往往预示着恶性程度更高的肾细胞癌病理亚型及组织学分级。然而,在肾细胞癌预后中腹腔内脏脂肪堆积却与更长的无进展生存期及总生存期相关。因此,了解腹腔内脏脂肪对肾细胞癌生物学行为的影响,对临床诊疗决策及预后评估具有重要意义。本文综述腹腔内脏脂肪在肾细胞癌生物侵袭性及预后评估中的作用。

NT-3基因逆转录病毒表达载体的构建

目的:分离大鼠神经营养素-3(NT-3)基因,构建pLEGFP-NT3逆转录病毒表达载体。方法:利用RT-PCR技术钓取大鼠NT-3基因,克隆到测序载体pMD18-T中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-C1中,通过Lipofectamine 2000导入包装细胞PA317。结果:RT-PCR产物为776bp,经测序鉴定虽与GenBank中NT-3基因的序列相差1个碱基,但不影响NT-3蛋白质的表达;构建的pLEGFP-NT3重组载体经酶切鉴定,证实NT-3基因片段正确插入pLEGFP-C1载体中。转染包装细胞后,激光共聚焦显微镜下观察导入NT-3基因的PA317细胞发绿色荧光。结论:分离得到了大鼠NT-3基因成功构建了pLEGFP-NT3表达载体。

大鼠大脑白质及白质内有髓神经纤维老年性改变的体视学研究

目的探讨老年大鼠大脑白质及白质内有髓神经纤维的改变。方法运用透射电子显微镜和体视学方法分别对年轻组和老年组Long-Evans大鼠大脑白质及其内有髓神经纤维进行定量研究。结果老年组大鼠大脑白质总体积,有髓神经纤维总长度分别下降了24.1%和41%;老年组大鼠有髓神经纤维体积密度、髓鞘体积密度和纤维直径分别增加了30%、23.9%和31%,具有统计学意义。但是有髓神经纤维长度密度、有髓神经纤维总体积和髓鞘的总体积没有显著老年性改变。结论正常老年大脑的萎缩主要是由白质体积的下降引起的。正常老年大脑白质的有髓神经纤维总长度显著性降低,并且主要是由于白质内细小直径的有髓神经纤维丢失所造成的。

大鼠海马结构内有髓神经纤维老年性改变的体视学研究

目的探讨雌性Long-Evans大鼠海马结构及其内有髓神经纤维的老年性改变。方法运用透射电子显微镜和体视学方法分别对5只青年(6月龄)、5只中老年(18月龄)和6只老年(28月龄)雌性Long-Evans大鼠海马结构及其内有髓神经纤维进行定量研究。结果青年组、中老年组和老年组大鼠的海马结构总体积,海马结构内有髓神经纤维的体积分数和总体积,有髓神经纤维的长度密度和有髓神经纤维平均直径均未见显著性改变。中老年组大鼠海马结构内有髓神经纤维总长度与青年组相比增加了63.6%,老年组有髓神经纤维总长度与中老年组相比下降了47.5%,老年组有髓神经纤维总长度与青年组比较下降了13.8%。结论本研究结果进一步支持正常老年大脑的有髓神经纤维存在广泛性老年改变。

线粒体质量调控

线粒体是真核生物内拥有双层膜结构的细胞器,主要通过氧化磷酸化产生ATP,在细胞能量代谢、生命活动中发挥核心作用。在不同生理过程中,线粒体具有高度可塑性。正常情况下,线粒体的数量、形态以及功能总是维持相对稳定的状态,称之为线粒体稳态。当上述状态发生紊乱时,细胞能量供给、机体生命活动必然受到影响。为应对这种损伤,细胞进化出一套选择性清除受损线粒体的体系——线粒体质量调控(mitochondrial quality control,MQC)。近年来发现,蛋白酶体、分裂和融合以及线粒体自噬等在线粒体质量调控中发挥着重要作用,笔者就线粒体质量调控进行综述。

血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对大鼠脂肪分泌瘦素、脂联素和TNF-α的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂Candesartan对大鼠脂肪合成瘦素、脂联素、TNF-α等脂肪细胞因子的影响。方法20只雄性WistarKyoto大鼠分为对照组和治疗组,分别予以口服安慰剂和Candesartan(10mg·kg-1·d-1),监测摄食量和体重变化。17周后处死大鼠,收集附睾和肾周围脂肪组织并称重,分离脂肪细胞并测定直径;测定血浆生化、胰岛素、瘦素、脂联素和TNF-α;通过RT-PCR测定附睾脂肪瘦素、脂联素和TNF-αmRNA基因表达。结果治疗组大鼠体重和体内脂肪含量均较对照组减低;附睾脂肪细胞缩小;两组间血糖和胰岛素无显著差异。治疗组血浆瘦素水平和脂肪组织瘦素mRNA表达均降低,而血浆脂联素和脂肪组织脂联素mRNA表达增加。两组血浆TNF-α水平低于可测范围,治疗组脂肪TNF-αmRNA表达下降。结论血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂降低大鼠脂肪瘦素和TNF-α的合成和分泌,增加脂联素的合成和分泌。

结缔组织生长因子与器官纤维化

目的:通过综述结缔组织生长因子的研究现状,探讨结缔组织生长因子与器官纤维化的关系。资料来源:应用计算机检索美国NCBI PubMed数据库1988-01/2006-12相关结缔组织生长因子与器官纤维化方面的文献,检索词“connective tissue growth factor,fibrosis”,限定文献语言种类为English。资料选择:对资料进行初审,选取包括结缔组织生长因子与器官纤维化的文献,开始查找全文。纳入标准:具有原创性,论点论据可靠的实验文章。观点明确,分析全面的综述文章。文献主体内容与本课题联系紧密的文章。排除标准:具有明显实验设计和结果错误的文章及观点模糊的综述。质量评价主要考察资料的真实性、实施过程是否严密。资料提炼:共检索到336篇关于结缔组织生长因子与器官纤维化的文献,最终纳入32篇符合标准的文献。资料综合:结缔组织生长因子基因是即刻早期基因家族成员,可刺激细胞增殖、分化和凋亡、促进细胞外基质沉积、介导细胞粘附、刺激细胞迁移、促进胚胎发育、损伤修复及新血管的生成。在病理状态下,结缔组织生长因子作为转化生长因子β的下游因子在多种纤维化疾病的发生和发展中起重要作用。文章分别阐明了结缔组织生长因子及其超家族成员、结缔组织生长因子基因和蛋白质结构、受体、功能和生物学作用、致纤维化作用和与其相关的防纤维化策略。结论:通过抑制结缔组织生长因子的表达有望阻断和逆转纤维化进程。

肥胖与脂肪组织重构

肥胖是糖尿病、动脉粥样硬化、高脂血症和癌症发生发展的主要危险因素。肥胖发生时伴随着脂肪组织的重构,主要表现为各种细胞组成和功能的改变、血管新生、细胞外基质重构和炎症细胞浸润。深入研究脂肪组织重构对肥胖的防治具有重要意义。该文就肥胖发生时脂肪组织重构的最新研究进展进行综述。

小鼠血管内皮细胞的培养、鉴定及巨噬细胞移动抑制因子对其促增殖作用的研究

目的探讨小鼠血管内皮细胞的培养、鉴定方法及巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对其增殖活性的调节作用。方法取小鼠主动脉,去除周围的脂肪和结缔组织,将动脉环剪成0.5 mm大小,放入基质胶处理的12孔培养板内,待细胞长满,用胰酶消化后,取单细胞悬液用抗CD146免疫磁珠纯化,再用CD31抗体鉴定细胞纯度,按104个细胞/孔加入96孔板培养,细胞70%～80%融合时用不同浓度MIF或MIF抑制剂处理细胞,48 h后用甲基噻唑基四唑(MTT)检测细胞增殖程度。结果经CD146磁珠纯化后细胞纯度为95%以上,MTT检测结果显示低剂量MIF能促进血管内皮细胞的增殖,并具有剂量效应关系,而高剂量MIF则与MIF抑制剂一样,抑制血管内皮细胞的增殖。结论成功建立了简单可行的小鼠血管内皮细胞的体外培养方法,并证实一定剂量范围内的MIF能促进血管内皮细胞的增殖,说明MIF在血管内皮细胞的多种病理生理反应中起重要作用。

大鼠大脑白质无髓神经纤维老年改变的机制探讨

目的运用体视学方法研究大鼠大脑白质无髓神经纤维的老年性改变，探讨导致老年白质有髓神经纤维总长度降低的确切原因，并探讨性别因素在老年大脑改变中所起的作用。方法6-8月龄Long-Evans大鼠9只和18月龄同种大鼠8只。用电镜技术及相应的体视学方法计算白质内无髓神经纤维的体积密度、长度密度和白质内无髓神经纤维的总体积和总长度。结果雄性和雌性大鼠大脑白质无髓神经纤维总长度均无显著的老年性降低。白质内无髓神经纤维总体积在雌性组存在显著的老年性降低，从年轻组的平均32.79mm3下降到了老年组的平均18.60mm3。雄性大鼠无髓神经纤维总体积老年性降低虽无显著性，但也从年轻组的平均34.79mm3下降到老年组的平均24.02mm3，降低高达31%。年轻组与老年组的各项指标中雄性与雌性动物间均不存在显著的性差别。结论老年大鼠大脑白质存在大直径无髓神经纤维的显著性丢失，同时存在的细小直径的有髓神经纤维脱髓鞘改变，在一定程度上掩盖了老年白质内小直径无髓神经纤维的丢失。

RNA干扰选择性下调血管平滑肌细胞结缔组织生长因子的表达

目的:从血管平滑肌细胞结缔组织生长因子的基础分泌及转化生长因子β1对其分泌的诱导作用入手,进一步观察并验证RNA干扰技术靶向抑制结缔组织生长因子对下游纤维化因子的影响。方法:实验于2006-03/2007-05在武汉协和医院心血管病研究所实验室完成。①实验材料:健康雄性成年SD大鼠,体质量150～180g。②实验方法及分组:分离培养成年大鼠血管平滑肌细胞,以5μg/L终浓度转化生长因子β1对培养的血管平滑肌细胞进行诱导,再通过脂质体法将靶向大鼠结缔组织生长因子的shRNA干扰质粒转染入血管平滑肌细胞,200mg/L终浓度的G418筛选出稳定转染细胞株后培养增殖进入后续实验。将实验分为5组,分别为对照组,不给与任何干预措施;转化生长因子β1刺激组,在培养的血管平滑肌细胞培养液中加入转化生长因子β1(5μg/L终浓度)刺激诱导24h;HK阴性质粒对照组,血管平滑肌细胞常规培养3～5代后转染HK阴性质粒继续培养48h;RNA干扰组,先以转化生长因子β1(5μg/L终浓度)诱导刺激血管平滑肌细胞24h后再转染干扰质粒继续培养48h;单纯转染试剂组,细胞常规培养3～5代后仅加入lipo2000转染试剂。③实验评估:通过逆转录-聚合酶链反应和(或)蛋白免疫印迹技术进一步检测各组心肌细胞结缔组织生长因子、纤维连接蛋白mRNA及蛋白的表达。结果:①组织块贴附法培养的原代血管平滑肌细胞,可见大量细胞紧密排列成长梭形。②倒置荧光显微镜下观察,脂质体lipo2000转染血管平滑肌细胞瞬时转染效率仅有大约30%左右;而通过加入G418进行稳定转染后,几乎所有细胞均可被激发出亮绿色荧光,转染效率可达95%以上。③对照组结缔组织生长因子、纤维连接蛋白均有低水平的基础分泌,在予以转化生长因子β1诱导后表达显著升高(P<0.01);而在靶向特异性RNA干扰后,与转化生长因子β1刺激组比较,结缔组织生长因子及纤维连接蛋白的表达均被显著抑制(P<0.01);并且纤维化因子纤维连接蛋白及胶原的表达与促纤维化因子结缔组织生长因子的表达有显著相关性。结论:血管平滑肌细胞可自主分泌结缔组织生长因子及细胞外基质成分;而通过RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子后可阻抑血管平滑肌细胞分泌下游纤维化因子。提示血管平滑肌细胞可主动参与心血管重塑及纤维化,而RNA干扰靶向沉默结缔组织生长因子基因的表达可以有效干预纤维化过程。