二型谷氨酸羧肽酶稳定表达细胞株的建立

为了深入研究二型谷氨酸羧肽酶 (glutamatecarboxypeptidaseⅡ ,GCPⅡ )功能和了解其在兴奋性氨基酸代谢过程中作用 ,拟构建GCPⅡ的表达载体 ,建立稳定表达细胞株 ;采用聚合酶链反应 ,酶切连接 ,和蓝白筛选的方法 ,构建表达载体 ;磷酸钙共沉淀的方法转染HEK2 93细胞 ,G4 18筛选阳性细胞克隆 ;逆转录聚合酶链反应和免疫荧光细胞染色的方法鉴定阳性细胞株。采用PCR方法扩增出GCPⅡ ;构建含有GCPⅡ基因的表达载体———pcDNA3 1 NA ;建立了细胞株HEK 2 93 NA。成功构建了GCPⅡ的表达载体 ,建立了稳定表达细胞株 ,为深入研究该酶的功能和兴奋性氨基酸毒性作用奠定了基础。

自体外周血干细胞移植降低下肢缺血性疾病患者截肢率及截肢平面:30例报告

目的:观察自体外周血干细胞移植对下肢缺血性疾病截肢率及截肢平面的影响。方法:选择2003-11/2004-07解放军第四六三医院30例下肢缺血性疾病患者,已行单侧下肢截脚术3侧,均经药物治疗疼痛及创面无改善,经彩色超声多普勒和血管造影检查显示有不同程度的下肢血管闭塞,临床已诊断以闭塞部位确定截肢平面。施行自体外周血干细胞移植治疗,观察移植治疗后截肢率和截肢平面的降低情况,以及经自体外周血干细胞移植治疗后足部皮温,踝脓比、经皮氧分压、疼痛的改善及创面愈合情况。结果:按实际处理分析,30例患者均进入结果分析。①降低截肢率情况:27例患者移植后截肢8例,截肢率为30%(8/27),截肢率降低了70%。②截肢患者降低截肢平面情况:3例已截肢患者行再次截肢,8例移植后截肢,移植术后截肢患者11例中拟截肢平面为大腿6例、小腿2例、足3例,实际截肢平面为大腿3例、小腿4例、足趾3例、趾1例。降低截肢平面者8例。③移植前后患足皮温和经皮氧分压变化情况:移植后患者皮温较移植前明显升高[(325±1.3],(28.1±1.5)℃,P<0.011,移植后经皮氧分压测定较移植前明显增高[(4.0±0.80),(3.2±0.53)kPa,P<0.01]。④移植后3个月局部疼痛及创面愈合情况随访;疼痛消失、剖面愈合11例;疼痛减轻,创面面积减少5例;疼痛减轻,创面面积无明显变化7例;无效7例。结论:外周血干细胞移植治疗下肢缺血性血管病,可促进剖面愈合,降低截肢率和降低截肢平面,无明显副作用及并发症,可望成为一种简单的、有效的治疗下肢动脉缺血性疾病的方法。

亚低温上调Sirt1减少氧糖剥夺后原代神经元细胞凋亡

为探讨亚低温对氧糖剥夺/复氧后原代神经元细胞自噬和凋亡的影响,运用原代神经元培养及OGD/R模型构建,CCK8测定细胞活力,TUNEL检测细胞凋亡,Western-blot检测Sirt1、Foxo1、Rab7、Beclin1、LC3及p53等蛋白的表达,以及转染mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒检测神经元自噬流等方法,成功培养原代神经元及构建OGD/R模型。结果发现OGD/R后Sirt1、P-Foxo1、Rab7、Beclin1、LC3b/LC3a表达随着时间延长逐渐减少,12 h更明显,与R6 h组相比,P<0.05,而p53增加,P<0.05;OGD3 h/R12 h,亚低温组Sirt1、P-Foxo1、Rab7、Beclin1及LC3b/LC3a表达均明显高于常温组,P<0.05,而p53明显低于常温组,P<0.05。R6 h亚低温组,神经元凋亡率为20%±6.7%,低于常温组的56.8%±7.6%,P<0.05。mRFP-GFP-LC3自噬双标观察法显示亚低温组自噬溶酶体明显增多,P<0.05。实验显示原代神经元OGD/R后亚低温干预可以上调Sirt1的活性,增加Foxo1、Rab7和自噬相关蛋白Beclin1、LC3b/LC3a的表达,同时抑制p53,促进神经元自噬,减少凋亡。

应用基因本体数据库分析中波紫外线对HaCaT细胞microRNA表达的影响

目的应用基因本体(GO)数据库分析中波紫外线(UVB)对人永生化角质形成细胞(Ha Ca T细胞)micro RNA(mi RNA)表达的影响。方法 Ha Ca T细胞根据UVB强度(100m J/cm^2、200 mJ/cm^2、400 mJ/cm^2)及辐照时间(12～24 h)的不同组合,完成7张mi RNA芯片[(对照、100 mJ/cm^2(12 h)、100 mJ/cm^2(24 h)、 200 mJ/cm^2(12 h)、200 mJ/cm^2(24 h)、400 mJ/cm^2(12 h)、400 mJ/cm^2(24 h)]的制作及扫描,筛选差异表达的mi RNAs,采用Target Scan进行靶基因预测,并对其进行基于GO数据库的功能富集分析。结果不同强度UVB辐照HaCaT细胞后均出现差异miRNA表达,其中400 mJ/cm^2 UVB处理组的miRNA差异表达最为明显,根据差异倍数(fc)筛选9个miRNAs拟进行后续实验研究,分别为上调表达的miR-8063、miR-1273f、miR-4497、miR-4778-5p、miR-6510-5p和下调表达的miR-1973、miR-5100、miR-205-3p、miR-4485-3p。靶基因预测及GO富集分析发现部分靶基因功能涉及T淋巴细胞介导的细胞毒作用、T淋巴细胞耐受、B淋巴细胞分化、自然杀伤细胞增生、树突细胞抗原处理提呈、免疫球蛋白产生以及中性粒细胞稳态等方面。结论 UVB作用HaCaT细胞后存在差异表达miRNAs,其靶基因功能与体液免疫和细胞免疫相关。