镉暴露对肾细胞凋亡、自噬、氧化损伤及TGF-β1/Smad3/miRNAs信号通路的影响

目的探讨镉(Cadmium,Cd)对人胚胎肾细胞293[human embryonic kidney(HEK)293 cell line,HEK293]细胞凋亡、自噬、氧化损伤以及转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-beta 1,TGF-β1)/Smad同源物3(SMAD3)重组蛋白(Recombinant SMAD family member 3,Smad3)/微核糖核酸(microRNAs,miRNAs)信号通路的影响。方法用氯化镉(Cadmium chloride,CdCl2)处理HEK293细胞6、12和24 h(model),将不做任何处理的细胞设为空白组(control)。通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)检测细胞增殖,通过Annexin V-异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)双染法检测细胞凋亡,通过水溶性四氮唑-1(Water-soluble tetrazolium salt-1,WST-1)法检测超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活力,染色试剂盒检测细胞自噬,蛋白印迹(Western Blot,WB)检测TGF-β1和Smad3蛋白表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测miR-21的表达。在此基础上,HEK293细胞分别用TGF-β1/Smad3通路阻断剂SIS3(CdCl2+SIS3组)、miR-空白对照(Negative Control,NC)(CdCl2+miR-NC组)以及miR-21 inhibitor(CdCl2+miR-21 inhibitor组)处理48 h,检测经不同方法处理后Cd暴露HEK293细胞凋亡、自噬、氧化损伤变化,以及TGF-β1/Smad3/miRNAs信号通路相关因子的表达水平。结果同一剂量下CdCl2染毒HEK293细胞(模型组)增长速度呈现时间效应变化,增长速度明显变慢。Cd暴露后,模型组细胞凋亡率(83.09±5.42)%、自噬率(77.16±8.91)%以及TGF-β1、Smad3蛋白表达量均显著高于对照组,模型组细胞中SOD活力显著高于对照组(P<0.05)。阻断TGF-β1/Smad3信号通路后,SIS3组细胞凋亡率(51.32±5.32)%、自噬率(43.52±2.46)%、TGF-β1、Smad3蛋白表达量均较模型组降低,SOD活力较模型组升高(P<0.05)。下调Cd暴露HEK293细胞中miR-21的表达后,与NC组比较,miR-21 inhibitor组细胞凋亡率(46.18±4.95)%、自噬率(40.56±6.42)%、TGF-β1、Smad3蛋白表达量均显著下降(P<0.05),SOD活力相对升高。结论Cd暴露引起肾细胞的氧化损伤、自噬与凋亡,并表现出一定的时间依赖性。环境Cd暴露可引起TGF-β1/Smad3相关miRNA-21的表达升高而导致肾功能损伤,并且相关miRNA-21可能通过TGF-β1/Smad3通路在暴露诱导的肾细胞自噬、凋亡与氧化损伤等过程中发挥一定作用。

骨桥蛋白在尿结石绵羊泌尿系统的表达和定位

为了研究骨桥蛋白在患尿结石绵羊泌尿系统的表达和定位,探索其与绵羊磷酸盐尿结石发病的关系。采用Western Blot和免疫组织化学技术,对骨桥蛋白在患尿结石绵羊和健康绵羊肾脏、膀胱中的蛋白表达水平和定位进行研究。结果显示,骨桥蛋白在患病绵羊肾、膀胱组织中平均蛋白表达量和免疫组化光密度值都高于健康绵羊。表明骨桥蛋白与绵羊磷酸盐尿结石形成有关。

姜黄素对293细胞固醇调控报告系统的作用

目的在人胚肾细胞系HEK-293中建立低密度脂蛋白受体基因表达的固醇调控报告系统,通过姜黄素的干预培养,从基因调控水平上阐明姜黄素降脂作用的机制。方法将绿色荧光蛋白报告基因构建在调控低密度脂蛋白受体基因表达的固醇调控元件的下游,经磷酸钙沉降法导入HEK-293细胞,在用含姜黄素的培养液中培养2 d后,用荧光显微镜及流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达情况进行定性定量分析。结果姜黄素诱导了绿色荧光蛋白的表达。结论姜黄素可以通过影响固醇调控元件的作用上调低密度脂蛋白受体基因的表达。

“胡桃夹”现象在正常儿童人群中的百分比及临床意义

目的探讨"胡桃夹"现象在正常儿童人群中出现的百分比及临床意义。方法回顾性分析2012年1月至2016年3月在重庆医科大学附属儿童医院放射科因非肾脏相关疾病行CT血管成像(computed tomographic angiography,CTA)检查的儿童腹部CTA影像及临床资料,共246例,男131例,女115例;年龄范围1月~<13.0岁,平均年龄(4.94±3.48)岁;所有儿童均除外左肾及左肾静脉相关疾病与变异,尿常规检查未见异常。按年龄分为7组:婴儿期(1月~<1.0岁)为1组,其他1.0~<13.0岁儿童以两岁为间隔分为6组。在CTA图像上,以同时具有左肾门部左肾静脉最大内径(D2)≥3倍腹主动脉与肠系膜上动脉间的左肾静脉内径(D1)以及腹主动脉与肠系膜上动脉之间的夹角(aortomesenteric angle,AMA)<45°为标准,判断是否存在"胡桃夹"现象,分析"胡桃夹"现象在正常儿童人群出现的百分比,以及AMA的变化。结果 246例中,34例(13.82%)出现"胡桃夹"现象,婴儿组出现百分比为0%,余下各组百分比依次为5.77%(3/52),12.20%(5/41),16.67%(8/48),18.75%(6/32),23.81%(5/21),28.00%(7/25),各年龄组"胡桃夹"现象出现的百分比存在显著的等级趋势性增高差异(χ~2=13.879,P<0.01),年龄越大出现百分比相对越高,而AMA随年龄的增大逐渐变小。结论 "胡桃夹"现象在正常儿童人群出现的百分比约为13.82%,其可以作为一种正常的解剖变异出现在一部分正常儿童中,正确认识这一现象可避免将其过度诊断为"胡桃夹"综合征。

甲氨蝶呤与左乙拉西坦在大鼠体内的相互作用研究

目的研究口服甲氨蝶呤与左乙拉西坦在大鼠体内的相互作用及肝肾毒性,为临床合理使用两药提供一定的理论依据。方法雄性SD大鼠随机分为3组:1 mg·kg^(-1)甲氨蝶呤组、180 mg·kg^(-1)左乙拉西坦组、合用组,每组5只,用于药代动力学参数研究、肾脏排泄研究、肝肾毒性研究。本实验样品均采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC/MS/MS)法测定。结果两药合用后,甲氨蝶呤的C_(max)、AUC_(0-t)、T_(max)值升高,T_(1/2)、Cl、MRT值下降,各参数差异有统计学意义。左乙拉西坦的T_(max)、T_(1/2)、Cl、MRT有一定的上升趋势,AUC_(0-t)有一定的下降趋势,各参数差异无统计学意义;两药合用后,甲氨蝶呤的肾排泄明显增加,左乙拉西坦的肾排泄明显降低;两药合用后大鼠的肝肾毒性明显增加。结论口服合用甲氨蝶呤和左乙拉西坦后,左乙拉西坦明显增加甲氨蝶呤在大鼠体内的吸收,使其血药浓度升高、肾排泄增加,造成明显的肝肾损伤,提示两药合用需进行剂量调整。

骨肿瘤端粒长度变化与相关蛋白表达的关系

目的:研究骨肿瘤端粒长度变化与端粒结合蛋白即端粒重复结合因子1(TRF1)和端粒保护因子(POT1),端粒酶催化亚单位(hTERT),肿瘤相关基因P53、c-myc表达的关系,以了解骨肿瘤的分子特征。方法:采用免疫组织化学、端粒定量荧光原位杂交(Telo-FISH)和原位杂交检测了20例骨肉瘤、25例软骨肉瘤、14例骨的纤维结构不良中端粒长度、TRF1、POT1、hTERT、P53、c-myc的表达情况,并进行统计分析。结果:20例骨肉瘤平均长度为0.31,25例软骨肉瘤为0.41,14例骨的纤维结构不良为0.52。统计显示三者间端粒长度有显著差异(P<0.05)。骨肉瘤和软骨肉瘤TRF1、POT1阳性率均显著低于骨纤维结构不良(P<0.05)。而骨肉瘤和软骨肉瘤hTERT基因表达显著高于骨纤维结构不良(P<0.05)。骨肉瘤、软骨肉瘤P53、c-myc阳性率高于骨纤维结构不良(P<0.05)。统计分析骨肿瘤端粒长度变化与端粒结合蛋白TRF1、POT1的表达呈负相关性,与端粒酶hTERT基因表达、与P53蛋白核聚积,以及c-myc癌基因表达呈正相关性。结论:骨肿瘤端粒长度与恶性表型有关、端粒短缩与肿瘤基因突变相关。

MSS4在缺血再灌注损伤大鼠肾脏中的表达及作用

目的探索MSS4在缺血再灌注损伤(IRI)大鼠肾脏中的表达情况,以及在缺氧/复氧大鼠肾小管上皮细胞中的作用。方法雄性成年SD大鼠分为假手术组和IRI组,分别予以假手术和肾脏缺血再灌注处理(双侧肾蒂夹闭45 min后再灌注),分别于术后0、12、24、48、72 h收集血液及肾组织标本。自动分析法检测各组大鼠血尿素氮、血肌酐水平,肾组织PAS染色评估肾小管损伤情况,Western blot检测肾脏组织中MSS4的表达水平,免疫荧光染色检测MSS4、Vimentin在肾组织中的定位及表达情况。大鼠肾小管上皮细胞(NKR-52E)分为对照组和复氧组,对照组正常培养,复氧组缺氧6 h后分别复氧0、12、24、48、72 h。免疫荧光检测各时间点MSS4和α-SMA的表达,大鼠肾小管上皮细胞转染siRNA MSS4后检测缺氧/复氧后α-SMA的表达变化。结果与假手术比较,IRI组血尿素氮、血肌酐及肾小管损伤评分术后12 h明显升高(P<0.05),72 h肾功恢复正常,肾小管损伤未完全恢复。MSS4的表达水平在IRI后48 h开始升高,72 h更明显(P<0.05)。肾组织免疫荧光染色显示MSS4与Vimentin均定位于肾小管上皮细胞,72 h表达水平明显高于假手术组(P<0.01)。细胞免疫荧光染色显示,与对照组比较,复氧组复氧72 h后MSS4及α-SMA的表达水平明显增加(P<0.05),转染siRNA MSS4后α-SMA的表达明显降低(P<0.01)。结论MSS4在IRI大鼠肾脏中表达增加,参与AKI后肾小管上皮细胞上皮间质转化的调控。

AMPK在姜黄素诱导CaOV3人卵巢癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)系统在姜黄素诱导CaOV3人卵巢癌细胞凋亡中的作用及姜黄素对AMPK磷酸化水平及其信号通路的影响。方法:实验分为对照组、姜黄素单独作用组、compound C(AMPK抑制剂)预给药组,SB203580(p38抑制剂)预给药组,AMPK抑制剂单独作用组以及p38抑制剂单独作用组。Western blotting法检测AMPK、p38和p53的磷酸化水平,MTT法检测细胞活力。结果:与对照组相比,姜黄素作用组的AMPK和p38磷酸化水平增加(P<0.05),与姜黄素单独作用组相比,SB203580预处理组的AMPK磷酸化水平下降(P<0.05)。姜黄素作用组的细胞活力低于对照组(P<0.05),compound C和SB203580预处理组的细胞活力高于姜黄素单独作用组(P<0.05)。与对照组相比,姜黄素作用组的p53磷酸化水平(Ser 15)增加(P<0.05),与姜黄素单独作用组相比,compound C(AMPK抑制剂)和SB203580预处理组的p53磷酸化水平(Ser 15)下降(P<0.05)。结论:姜黄素能激活CaOV3细胞的AMPK,而AMPK的激活依赖于p38。AMPK和p38调节p53的磷酸化,并介导姜黄素诱导的细胞凋亡。

Livin shRNA质粒载体的构建及评价

目的:构建有效的Livin shRNA重组质粒。方法:设计、合成Livin shRNA,与pGenesil-1质粒载体链接构建重组质粒,通过酶切电泳、基因测序证实是否正确构建,通过转染高表达Livin的大肠癌HT-29细胞检测Livin mRNA下降水平,筛选出最佳的shRNA。结果:重组质粒pGenesil-shRNA经酶切电泳、基因测序证明寡核苷酸片段成功插入预计位点,且序列与我们设计合成的完全一致;重组质粒载体转染HT-29细胞后,肿瘤细胞Livin mRNA含量较转染前及对照组均有明显的下降(p<0.01),其中尤以Livin1抑制作用明显,抑制率达到66%。结论:我们正确构建了Livin ShRNA重组质粒,且制备的shRNA能有效抑制Livin基因的表达,为探讨针对Livin基因的RNAi对肿瘤的治疗奠实验基础。