邻苯二甲酸二丁酯孕期暴露致仔鼠睾丸膜联蛋白A5的表达差异

背景:国内外关于邻苯二甲酸二丁酯导致雄性生殖系统畸形发生机制的探讨多集中于邻苯二甲酸二丁酯干扰胚胎期睾丸睾酮合成途径的研究,对其基因表达调控的因素及功能蛋白质之间相互干扰的网络效应却并不明了。蛋白质组学能够从整体水平反映蛋白质组分,并筛选功能相关蛋白。目的:探讨邻苯二甲酸二丁酯胚胎期暴露对胎鼠睾丸蛋白表达谱的影响,分离并鉴定差异表达蛋白质。设计、时间及地点:随机对照动物实验,实验于2006-08/2007-10在南京医科大学动物实验中心及南京医科大学生殖医学重点实验室完成。材料:将孕鼠随机分为实验组和对照组,每组5只。妊娠14～18d。方法:实验组按800mg/(kg·d)染毒孕鼠,对照组予大豆油5mL/d。妊娠21d取出胚胎大鼠睾丸,提取总蛋白,进行二维凝胶电泳分离和图像分析,筛选出的差异蛋白质点利用质谱技术进行鉴定,并选择关键蛋白进行验证。主要观察指标:①两组蛋白的电泳差异比较。②酶切,MALDI-TOF分析,数据库检索,生物信息学检索结果。③两组蛋白Western blotting检测及免疫组织化学染色结果。结果:共筛选出33个差异表达蛋白(t≥2.831,P<0.05),其中14个通过质谱分析和SwissProt蛋白数据库检索得到鉴定,包括膜联蛋白A5、过氧化物酶6、泛素羧基末端水解酶L1等。运用Western blotting,验证了膜联蛋白A5在实验组表达量明显高于对照组,通过免疫组织化学方法,发现膜联蛋白A5主要定位在胎鼠睾丸Leydig细胞中。结论:实验运用蛋白质组学方法,建立了邻苯二甲酸二丁酯孕期暴露雄性仔鼠睾丸与正常仔鼠睾丸蛋白质差异表达谱系,鉴定出14个蛋白点,确定了膜联蛋白A5在胎鼠睾丸的定位。

神经生长因子在不同周龄小鼠睾丸组织中的表达

目的研究神经生长因子在小鼠不同周龄睾丸组织中的定量和定位表达。方法分别剖取不同周龄雄性小鼠的睾丸组织,部分提取总RNA,real-time PCR相对定量分析神经生长因子mRNA的表达量;另外部分组织固定、包埋,进行SABC法免疫组化分析,以观察神经生长因子蛋白在各周睾丸组织中的定位。结果Real-timePCR定量分析表明:小鼠生后1周龄睾丸组织有神经生长因子mRNA的表达,生后3周龄表达量达峰值,5周之后随鼠龄的增加呈下降趋势,成年小鼠睾丸组织的神经生长因子mRNA表达维持在一定水平。免疫组化定位分析显示:睾丸组织的神经生长因子蛋白表达于小鼠出生后的各个时期内,1周龄睾丸组织免疫阳性反应主要位于支持细胞,精原细胞也有着色;3周龄睾丸组织的间质细胞、各级生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞表达均呈现阳性;5周后的睾丸组织内神经生长因子呈低水平表达,主要表达于间质细胞和生精细胞内。结论神经生长因子mRNA的表达量随着小鼠睾丸的生长发育期存在着一定的规律性变化;神经生长因子蛋白的表达在小鼠睾丸生长发育的不同时期其主要表达部位不同。

不同病理睾丸组织中雄激素受体和热休克蛋白90α表达的差异

目的检查和分析不同病理睾丸组织雄激素受体和热休克蛋白90α表达的差异。方法运用免疫组织化学二步法检查精子发生停滞、精原细胞瘤、前列腺癌去势和正常健康睾丸标本之雄激素受体和热休克蛋白90α的表达情况。结果正常睾丸组织和前列腺癌去势睾丸中雄激素受体在间质细胞、支持细胞和精原细胞的胞核表达,前者的表达强度高于后者(P<0.05);热休克蛋白90α主要在类肌细胞、间质细胞、支持细胞核及生精细胞的胞浆表达。精子发生阻滞的睾丸组织,雄激素受体主要在支持细胞的胞核和生精细胞的胞浆表达,热休克蛋白90α主要在支持细胞、类肌细胞表达;精原细胞瘤的睾丸组织,雄激素受体在肿瘤细胞的胞浆和胞核表达,热休克蛋白90α的表达强度在精原细胞瘤组织高于对照标本。结论雄激素受体核转运异常与精子发生阻滞有紧密关系;前列腺癌去势患者睾丸组织中,雄激素受体免疫反应强度减弱与睾丸衰老有关;精原细胞瘤患者睾丸标本,雄激素受体表达减弱,但热休克蛋白90α表达增强;提示雄激素受体和热休克蛋白90α的表达异常与精原细胞瘤的病理发生有关。

DEHP体外影响大鼠睾丸间质细胞Bax和Bcl-2基因表达的实验研究

目的通过对原代培养的大鼠睾丸间质细胞进行邻苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)染毒,探讨DEHP体外对大鼠睾丸间质细胞Bax和Bcl-2基因表达及凋亡的影响。方法体外分离和原代培养未成熟大鼠睾丸间质细胞,用不同浓度的DEHP(10、50、100nmol/L)染毒24h。荧光定量PCR法检测间质细胞Bax和Bcl-2基因mRNA表达,Weastern blot检测间质细胞Bax和Bcl-2蛋白表达,流式细胞术检测间质细胞凋亡率。结果与对照组相比,DEHP各组睾丸间质细胞Bcl-2基因mRNA和蛋白表达下降(P<0.05),Bax基因mRNA和蛋白表达增加(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),呈浓度依赖关系。结论 DEHP可通过抑制Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达诱导大鼠睾丸间质细胞凋亡,进而影响间质细胞功能。

胃肠激素在睾丸生殖中的研究现状及应用展望

胃肠激素是由胃肠道中内分泌细胞分泌的一组小分子高效能生物活性物质,在化学结构上属于肽类,故又称胃肠肽,广泛分布于体内各器官。它不仅可局部调节胃肠道自身活动,还可发挥生长因子、神经递质、生育因子、类性激素等多种作用,广泛调控全身代谢活动,与肿瘤、免疫与炎症、神经系统疾病及生殖障碍性疾病的发生发展关系密切[1]。

慢性束缚应激对小鼠睾丸生精功能及m6A甲基化酶表达的影响

目的探讨慢性束缚应激(CRS)对小鼠睾丸生精功能及m6A甲基化酶的影响。方法18只8周龄雄性C57 BL/6小鼠,随机分为空白对照组(Control)和慢性束缚应激组(CRS)(每天在圆筒内慢性束缚6 h,连续35 d)。小鼠睾丸和附睾尾称重,进行精子计数,精子活率、畸形率检测及对睾丸形态结构变化等进行H&E染色检测;使用qRT-PCR和Western blot检测各组小鼠睾丸组织中m6A甲基化酶mRNA及蛋白表达的变化。结果与Control组相比,CRS组小鼠睾丸以及附睾重量有下降的趋势,精子数量下降、精子畸形率增高及精子活率降低差异有统计学意义;与Control组相比,CRS组小鼠睾丸形态结构破坏,各级生精细胞排列紊乱,管腔内精子数量减少;qRT-PCR结果显示,与Control组相比,CRS组小鼠睾丸m6A甲基化转移酶WTAP mRNA表达降低,去甲基化酶ALKBH5及甲基识别酶YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF3 mRNA表达增高,差异有统计学意义。Western blot结果显示,与Control组相比,CRS组小鼠睾丸m6A甲基化转移酶WTAP蛋白表达降低,去甲基化酶ALKBH5及甲基识别酶YTHDC1蛋白表达增高,差异有统计学意义。结论CRS导致小鼠出现生精功能障碍,其生精障碍可能与睾丸内m6A甲基化酶异常变化有关。

IDEAL序列在营养性肥胖男童睾丸脂肪含量评估中的应用

目的探究IDEAL序列的同相或反相位成像技术在营养性肥胖男童睾丸脂肪含量评估中的价值。方法共有43人进入研究，包括营养性肥胖的男童30例，年龄7—15岁，平均年龄11．4岁，体质量正常的男童13例，年龄7～16岁，平均年龄11．8岁。再分别按年龄分为10岁及以下组和10岁以上组。所有研究对象测量身高、体质量，计算体质量指数（BMI）。用IDEAL序列进行同相或反相位成像，计算睾丸的脂肪信号强度（FSF）。结果肥胖男童的睾丸脂肪信号强度大于体质量正常男童。结论MRIIDEAL序列的应用作为一种无创性的影像学检查方法，对临床肥胖男童的睾丸脂肪浸润评估提供了客观的依据。

睾丸特异性新基因T490真核荧光表达载体的构建及其表达

目的构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的睾丸特异性新基因T490超表达质粒pDT490-EGFP,检测其在Hela细胞中的表达情况。方法采用RT-PCR的方法从成年Balb/c小鼠睾丸组织中扩增T490基因,将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,再将T490和EGFP融合基因酶切下来,克隆到pcDNA3.1(-)真核超表达载体上,以构建重组质粒pDT490-EGFP。将该重组质粒通过阳性脂质体Lipofectamine 2000导入Hela细胞系中,在荧光显微镜下观察转染24h后融合基因的超表达情况,并用RT-PCR的方法进一步证实目的基因mRNA的表达水平。结果RT-PCR获取编码T490基因的全序列cDNA,大小为508bp;DNA测序和PCR方法证实T490和EGFP融合基因成功克隆到真核超表达载体上;在荧光显微镜下,转染24h后的Hela细胞具有很强的绿色荧光;RT-PCR显示转染后的Hela细胞T490基因mRNA的表达明显。结论重组质粒pDT490-EGFP构建成功,并在细胞内明显表达,此质粒可应用于研究睾丸特异性新基因T490的功能,为T490的生物学研究奠定基础。

钴60-γ射线致小鼠睾丸支持细胞结构及功能的损害古

目的探讨不同剂量钻60（^60Co）-γ射线致小鼠睾丸支持细胞结构及功能急性损伤的程度。方法40只健康雄性KM小鼠，采用随机数字表法平均分为4组（n=10）：正常对照组（A组）和^60Co-γ射线双侧睾丸局部照射的3个不同剂量组，分别为剂量2Gy（B组）；剂量6Gy（C组）；剂量10Gy（D组），下腹部均匀照射517S。照射完成48h后，采用酶联免疫吸附法测量血清卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，FSH）、促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）及抑制素β（Inhibinβ）水平；应用光学显微镜观察小鼠睾丸组织形态学变化；应用实时定量PCR法测定睾丸组织中Inhibin β mRNA相对表达量。结果^60Co-γ射线照射组（B、C、D组）较正常组（A组）血清FSH水平显著提高（P〈0．05），InhibinB水平显著降低（P〈0．05）；光镜下见睾丸支持细胞和生精细胞发生不同程度的损伤，以D组损伤程度最为明显；睾丸组织Inhibin β mRNA表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论^60Co-γ射线对睾丸支持细胞结构及功能有明显损伤作用，且损伤程度与照射剂量呈正相关性。

CXCL6基因在大鼠睾丸组织发育过程中的表达

目的检测CXCL6基因在大鼠发育睾丸组织中的表达,探讨该基因在精子发生过程中的作用。方法取三组不同窝别来源,出生2到65日龄之间,21个时间点的雄性大鼠的睾丸组织,采用Real-time PCR方法检测CXCL6基因的转录表达。采用免疫组织化学染色的方法检测65日龄大鼠睾丸组织中CXCL6的表达情况。结果CXCL6基因m RNA表达在大鼠出生后第2天呈高表达,随后开始迅速下降,在第8天下降到最低值,一直持续到第16天。从第20天起迅速线性升高表达,在第29天达到整个发育过程的最高值之后开始下降。第35天可见CXCL6基因的表达再次呈现升高趋势,在第45天形成一个小高峰表达之后,维持一定的表达量持续至第65天。免疫组织化学染色结果显示,CXCL6蛋白在精母细胞边缘和圆形精子以及长形精子处表达。结论CXCL6基因可能参与精原干细胞的增殖过程,并且可能在圆形精子的形成以及精子成熟的过程中发挥作用。

单侧隐睾后胶质细胞源性神经营养因子对另侧睾丸保护的机制研究

目的：大鼠单侧隐睾模型后，探讨胶质细胞源性神经营养因子（glial cell derived neurotrophic factor， GDNF）对另侧睾丸组织中超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、白细胞介素-6（IL-6）及睾丸特异性钙结合蛋白86-IV （testis -specific calcium binding proten，TS- CBP86-IV）的影响和机制。方法选取左侧隐睾造模成功雄性SD大鼠体质量（200＆#177;30）g，45只，随机分为，A：隐睾组（n=15）；B：生理盐水药物组（n=15）；C：GDNF组（n=15）；D：另选正常对照组（n=15）。每组根据设定处理方式的不同分别进行处理。采集对侧睾丸并行生化指标（SOD、CAT、MDA及IL-6含量）检测；免疫组织化学检测对侧睾丸细胞凋亡指数（AI）；HE染色观察对侧睾丸组织学形态；定时PCR法检测对侧睾丸组织中TS-CBP86-IV mRNA的表达。结果胶质细胞源性神经营养因子药物组（隐睾＋GDNF组）生精细胞凋亡明显减少，SOD活性上升，MDA含量下降，IL-6含量下降，TS- CBP86-IVmRNA基因表达明显增强，其与A组、B组、D组比较，差异均有统计学意义。结论 GDNF对单侧大鼠隐睾后对侧睾丸生精功能具有保护作用，并提高抗氧化酶系统的抗氧化及降低血清炎症因子能力，其机制可能与诱导TS-CBP86-IV基因表达有关。

血睾屏障与男性避孕

一、介绍血睾屏障(BTB)本质是生精小管与睾丸血液之间的一层屏障,由间质的毛细血管内皮基膜、结缔组织、生精上皮基膜、生精细胞及支持细胞通过紧密连接、胞质特化、桥粒和缝隙连接等连接复合体相互作用所形成[1-4].其特有的微观结构,为精子发生提供了适宜的微环境,并参与调节生物分子的运输以及作为精子发生的免疫屏障[5].血睾屏障对男性生育具有重要意义.然而,血睾屏障作为哺乳动物的组织屏障之一,也同样阻碍了男性避孕药进入睾丸发挥作用.

JMY蛋白在小鼠睾丸中的定位和作用研究

目的研究JMY蛋白在小鼠睾丸组织中的表达与定位,探索JMY在小鼠生精上皮中的功能。方法通过免疫荧光技术和免疫印迹技术确定JMY在小鼠睾丸中的表达和定位情况。随后,分别建立支持细胞和原始生殖细胞特异性的Jmy条件基因敲除小鼠模型,并利用形态学分析、生殖能力评估和血睾屏障功能分析探索JMY缺失对精子发生的影响。结果JMY在睾丸支持细胞和精子细胞表达。支持细胞特异性的JmY条件基因敲除可导致雄鼠生育力、精争运动力和精子数量显著下降(Р<0.05),且生精小管中细胞排列紊乱,生精细胞大量脱落,血睾屏障完整性受损;另一方面,原始生殖细胞特异性的Jmy条件基因敲除雄鼠与野生型小鼠相比,其生育力、精子质量、睾丸结构无显著差异。结论在生精小管支持细胞中,JMY参与维持血睾屏障功能,进而对生精上皮结构和精子发生具有重要作用。