PTPMeg2的PTP结构域对磷酸化STAT3入核的抑制作用

目的探讨PTPMeg2结构域对磷酸化STAT3核转位的影响。方法采用免疫共沉淀技术研究PTPMeg2与STAT3不同结构域的相互作用,采用GST pull down实验研究STAT3与PTPMeg2不同结构域的相互作用,用激光共聚焦显微镜直接观察PTPMeg2对磷酸化STAT3细胞定位的影响。结果 STAT3与PTPMeg2的所有结构域均有相互作用,PTPMeg2的PTP结构域和△SEC结构域(PTP结构域+LK结构域)可以抑制磷酸化STAT3入核。结论 PTPMeg2的PTP结构域对磷酸化STAT3的入核具有抑制作用。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因与脂质代谢

1前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)简介Seidah等〔1〕在研究神经元发育分化时发现一个新基因,称为PCSK9,该基因编码是一种前蛋白转化酶,名为神经细胞凋亡调节转化酶1(NARC)-1,该酶参与肝细胞发育再生和神经细胞分化〔1〕。后续研究发现,PCSK9蛋白能靶向降解低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR),与脂质代谢、异常胆固醇血症及动脉粥样硬化等有密切关系。

Cidec研究进展

诱导细胞死亡的DFF45样效应因子C(Cidec)又名脂肪特异性蛋白27(FSP27),最先在小鼠脂肪细胞中分离得到,随后在人肝细胞、脂肪细胞等细胞中相继发现,属于Cide家族。研究发现,Cidec蛋白可定位于脂肪细胞的脂滴表面,促进脂肪的储存和脂滴体积的增大,进而调节脂肪代谢和机体能量平衡。Cidec在细胞凋亡方面也发挥着重要作用。

白细胞介素18基因工程表达方法

目的探讨人白细胞介素(IL)-18基因工程表达方法。方法复苏含有p GEX-IL-18重组体质粒的E.coli JM109,并进行增菌培养;利用质粒提取试剂盒提取p GEX-IL-18重组体质粒,通过琼脂糖凝胶电泳、基因片段测序、基因库比对等技术鉴定IL-18基因序列;将提取得到的p GEX-IL-18重组体质粒转化到DH5α,制成高效表达的IL-18原核表达系统。结果含有p GEX-IL-18重组体质粒的E.coli JM109增菌培养后提取质粒,酶切电泳与Marker比对,证实质粒大小2.7 kb;经测序并利用基因库比对证实,所制备的DNA片段符合IL-18基因序列。将p GEX-IL-18转染DH5α细菌内,并经过蓝白筛选系统进行筛选,证实转染成功。结论经过系统的实验研究,成功建立了IL-18的基因工程表达系统。IL-18具有重要的生物学功能,在后续的科研工作中将对IL-18的应用价值进行系统研究。

人重组5-脂氧合酶基因真核表达载体的构建和鉴定

基因表达载体的构建是进一步研究相应基因功能的基础.该文详细地介绍了人5-脂氧合酶基因真核细胞表达载体的设计理念和构建方法,并通过转染、western blotting等方法鉴定了该载体在HEK293T细胞中的表达.

人IFN-γ基因启动子的克隆鉴定及功能分析

目的克隆鉴定人IFN-γ基因启动子序列,并进行功能分析。方法通过生物信息学方法预测启动子区域,PCR克隆至pGL3报告载体,双荧光素酶法检测启动子活性。结果克隆得到人IFN-γ基因翻译起始点上游700 bp启动子区域,经检测具有活性,可启动报告基因表达;同时,该区域DNA被甲基化修饰后启动活性下降达4倍。结论克隆构建人IFN-γ基因启动子成功。

CARP-1(Cell Division Cycle and Apoptosis Regulator Protein 1)的生物功能和表达模式探究

本文对CARP-1生物功能和表达模式进行了研究,结果表明,作为一个关键的细胞内复合物,传感激活细胞的增殖或凋亡信号通路,在经典Wnt通路中,CARP-1与β-catenin功能共激活,协助β-catenin在Wnt目标基因作用中的转录激活,涉及到一些蛋白信号的扩散和转移;参与caspase泛素化蛋白酶途径,与APC/C复合,在CFM-4的阻碍作用下,阻滞G2/M细胞周期;与P53、P160复合,刺激靶细胞激素代谢,调控细胞周期,通过增强CDK1和P21的水平来调节细胞凋亡。

LV3-KiSS1-miRNA的构建及其在体内外沉默效应观察

目的构建靶向Ki SS1基因的miRNA慢病毒质粒(LV3-Ki SS1-miRNA),并观察其在人胚肾293T细胞及SD大鼠体内的沉默效应。方法利用四质粒系统合成LV3-Ki SS1-miRNA,分别用LV3-Ki SS1-miRNA(观察组)、LV3-N-miRNA(对照病毒组)、细胞培养液(空白对照组)与Ki SS1的真核表达载体pc DNA3.1(+)-Ki SS1共转染293T细胞,72 h后采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)阳性表达率,RT-PCR法检测细胞中的Ki SS1 mRNA。将90只21日龄SD大鼠随机分为3组各30只,分别侧脑室注射LV3-Ki SS1-miRNA(干扰病毒组)、LV3-N-miRNA(对照病毒组)和生理盐水(生理盐水组)40μL,采用RT-PCT法检测30、35、45日龄时大鼠下丘脑组织中的Ki SS1mRNA。结果空白对照组中无GFP表达,而观察组与对照病毒组的GFP表达率分别为89.4%、94.2%。观察组与对照病毒组、空白对照组比较Ki SS1 mRNA表达量减少(P均<0.01),沉默效率达到86%;对照病毒组与空白对照组比较,P>0.05。干扰病毒组大鼠各日龄时下丘脑组织中Ki SS1 mRNA表达水平明显低于生理盐水组和对照病毒组(P均<0.05)。结论成功构建LV3-Ki SS1-miRNA,并能高效、稳定地抑制293T细胞及SD大鼠下丘脑组织中Ki SS1 miRNA的表达。

睫状神经营养因子基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的构建

背景 间充质干细胞作为基因转移的载体,已在多种疾病的研究中发挥作用.该方法可能为外源性神经营养因子在中枢神经系统,包括在视网膜中的应用提供更有效的途径. 目的 构建慢病毒介导的过表达睫状神经营养因子（CNTF）的骨髓间充质于细胞（BMSCs）,为眼科视网膜、视神经疾病的治疗提供新的方法.方法 对SD大鼠BMSCs进行培养和传代,第4代细胞用于实验.将全基因合成含信号肽的大鼠CNTF基因编码序列克隆至pHⅣ-dTomato慢病毒载体质粒,构建重组质粒CNTF-dTomato.CNTF-dTomato/pHⅣ-dTomato与慢病毒辅助质粒psPAX2及pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装,获得重组慢病毒CNTF-lenti及不含CNTF的control-lenti.以CNTF-lenti或control-lenti感染SD大鼠BMSCs,构建CNTF-BMSCs及空载-BMSCs细胞,根据红色荧光蛋白dTomato表达情况确定病毒感染效率;未感染lenti的BMSCs为空白-BMSCs.用ELISA法测定空白-BMSCs、空载-BMSCs及CNTF-BMSCs细胞培养液中CNTF的质量浓度.将CNTF-BMSCs向成骨和成脂2个方向诱导分化,并用茜素红S（ARS）染色和油红O染色对分化细胞进行鉴定.结果 CNTF-dTomato质粒转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞后,菌落PCR产物大小约为1 033 bp,质粒测序结果显示,pHⅣ-dTomato质粒中插入部分的碱基序列与预期序列一致,显示CNTF-dTomato质粒构建成功.重组慢病毒对BMSCs的感染率达95％.ELISA检测结果显示,感染后2、3、4、7d,CNTF-BMSCs组细胞上清液中CNTF蛋白的质量浓度明显高于空白-BMSCs组及空载-BMSCs组,差异均有统计学意义（均P=0.000）;CNTF-BMSCs组感染后2、3、7d细胞上清液中CNTF质量浓度均明显高于感染后1d,差异均有统计学意义（P=0.013、0.004、0.042）.CNTF-BMSCs经成脂培养基诱导后分化的细胞油红0染色呈红色着染,经成骨培养基诱导后分化的细胞ARS染色可见橘红色钙结节. 结论 本研究成功构建CNTF-dTomato质粒,利用慢病毒载体可成功构建稳定过表达分泌型CNTF的大鼠BMSCs,CNTF-BMSCs具备向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能.

酸性成纤维细胞生长因子研究进展

酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factors,aFGF)是成纤维细胞生长因子家族(fibroblast growth factors,FGF)中的一员,是一种重要的生长因子,具有广泛的生物活性和临床应用价值。本文概述了aFGF的结构与功能关系和信号传导通路,阐述了aFGF生理功能与生物学效应以及潜在临床应用价值。

克隆人Toll样受体9基因和转染真核细胞对CpG的反应

目的克隆人Toll样受体9(TLR9)基因,重组入真核表达载体,转染真核细胞,检测对CpG的反应。方法利用逆转录PCR从人外周血mRNA扩增TLR9基因;TLR9基因定向重组入真核表达载体pcDNA3.0;利用磷酸钙转染方法导入肝癌细胞系SMMC7721,经G418培养筛选,克隆出携有人TLR9 CDNA的细胞系;用不同的CpG刺激转染的细胞系观察生长率。结果逆转录PCR扩增出3.0 kb的DNA片段,经TA克隆和细胞DNA序列分析为人TLR9基因全序列;利用定向克隆的方法将人TLR9基因成功重组入pcDNA3.0。结论制备的SMMC7wgq-TLR9系可以用于CpG研究。

LincRNAs的研究新进展

一直以来生物医学研究的主流焦点在于阐明细胞中蛋白质的功能和相互作用。在分子生物学中心法则中,RNA一度被视为蛋白生产的中介和DNA的前体分子。然而,RNA 85%以上从基因组区域转录,而蛋白编码在人类基因组序列不超过3%。在细胞的基本功能方面,曾经认为RNA只限定于一些重要和进化相关的功能,如tRNA、rRNA和mRNA。功能性RNA或具有酶样活性的RNA,被认为是进化残余。在很长的一段时间里,非编码RNA(ncRNA的)

阳离子磷酸胆碱聚合物载AT1受体反义寡核苷酸转染大鼠心肌成纤维细胞的研究

目的:探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载AT1受体的反义寡核苷酸(AS-ODN)对离体培养的大鼠心肌成纤维细胞AT1受体及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法:MTT法检测MPC与心肌成纤维细胞的细胞相容性;应用激光扫描共聚焦显微镜(CLAM)检测复合物在细胞内的定位,流式细胞仪(FCM)检测转染效率及荧光强度,Western blot检测AT1受体蛋白、Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果:MPC浓度>40μg/mL时才出现明显细胞毒性,激光共聚焦显微镜观察到FAM标记的基因复合物多数分布在细胞核周围,少量分布于细胞核内。流式结果显示转染效率及荧光强度随N/P比增加而明显增大。Western blot结果显示,转染复合物后各组细胞AT1受体及Ⅰ型胶原蛋白的表达也相应减少。结论:MPC30-DEA70在安全浓度范围内就能够携带AT1R-ASODN以较高的转染率进入离体培养的大鼠心肌成纤维细胞,并成功靶向抑制AT1R及Ⅰ型胶原蛋白的表达。从而可以推断阳离子磷酸胆碱聚合物可以有效负载反义寡核苷酸(AS-ODN),靶向性抑制基因的表达,为新型非病毒性基因载体的研究提供了一定的理论依据。

MAS基因在不同组织表达量的差异分析研究

肾素-血管紧张素是人体肿瘤微环境的重要组成部分。肾素血管-紧张素素系统(RAS)是人体非常重要的调节系统。RAS系统包含经典轴ACE-AngII-AT1R和替代经典轴的ACE2-Ang(1-7)-Mas。作为非经典替代轴受体的MAS基因,发挥了重要的拮抗经典轴的作用。在之前的研究中,我们对MAS基因在肝癌中的表达差异做了研究,发现其在肝癌组织和血清中的表达均高于健康对照组。有报道称,MAS基因在其它组织中也有异常表达。目的:分析MAS在不同组织中的表达情况,并分别与对应的癌旁组织对照,更加全面的了解MAS基因在人体不同组织的表达情况。方法:本文通过生物信息学手段分析MAS在人体不同部位的表达差异,数据来源GEO数据库。结果:结果显示MAS基因在心脏中的表达最高,并且其在癌组织中的表达量均高于其对应的癌旁组织。结论:综上所述,提示我们MAS基因在人体中扮演着重要的角色,本文将为研究MAS基因的拮抗机制提供更好的思路。

piRNA的生物功能和研究技术

pi RNA(PIWI-interacting RNA)是近年来发现的一种非编码小RNA(non-coding RNA nc RNA)。它主要在生殖细胞中表达,与生殖系统DNA完整性、翻译过程、转座子转录和动物生育能力的调节等有关。该文对pi RNA沉默转录过程、pi RNA芯片技术、生殖系和干细胞维护及pi RNA在癌症治疗等方面的最新进展进行总结,并对这些方面进行了简单评述。

MicroRNA:疾病诊断的潜在生物标记物

MicroRNAs(miRNAs)是一类具有高度保守性内源性非编码的小RNAs,许多研究都表明miRNAs表达的异常或缺乏通常被认为与病理生理紊乱相关。本文介绍mi RNAs的生物学特性,分析mi RNAs作为生物标记物的前景以及mi RNAs应用于人类疾病诊断的优点。

新的糖脂代谢调节因子betatrophin研究进展

血管生成素样蛋白家族（Angptls）是近年发现的一类新的分泌性糖蛋白家族，目前发现成员有Angptls 1—7，作为一类新的分泌性糖蛋白家族，Angptls在代谢和血管生成中的作用已得到广泛关注。其中大量的证据证明，ANGPTL3和ANGPTIA在调控血浆甘油三酯水平方面发挥重要的作用，包括小鼠和人类的体内体外研究。

核酸提取方法的研究进展

随着近年来分子生物学技术的高速发展，以核酸杂交、核酸扩增和核酸序列分析为代表的分子诊断和检测技术在诸多领域中日益凸显出至关重要的作用。新型的分子生物学检测技术包括聚合酶链反应（PCR）、微芯片、高通量测序等，然而，所有现代分子生物学检测技术首先面临的问题就是如何从复杂多样的生物样本中迅速有效地分离和提取所需要的基因组核酸，而且抽提后的核酸质量及其完整性都会直接影响到随后的实验结果。目前，全世界的研究者在核酸分离提取的技术方法上也取得了许多突破性的进展，本文将就新型的核酸分离提取方法作一综述。

Annexin A5基因沉默对Hep-2细胞凋亡的影响

目的 探索annexinA5基因及其表达沉默后对人喉癌Hep-2细胞凋亡的影响.方法 培养人喉癌细胞Hep-2,经Lip2000转染特异siRNA片段沉默annexin A5基因;TRlzol法提取细胞总RNA;RT-PCR法检测annexinA5在mRNA水平的表达是否降低;Western blot法检测annexin A5的蛋白表达是否下降;经流式细胞仪AnnexinV-FITC法检测annexin A5基因沉默后的人喉癌Hep-2细胞的凋亡情况.采用SPSS 13.0软件对数据进行单因素方差分析.结果 特异siRNA片段成功转入Hep-2细胞;RT-PCR结果显示实验siRNA组、阴性siRNA组、脂质体组及空白细胞组的相对灰度值为0.70±0.03、1.18±0.05、1.17±0.06及1.23±0.07;经统计学分析表明实验组annexin A5在mRNA水平的灰度明显弱于阴性siRNA组（t=-14.77）、脂质体组（t=-13.23）及空白细胞组（t=-12.99）,P值均＜0.05;Western blot结果显示实验siRNA组、阴性siRNA组、脂质体组及空白细胞组的相对灰度值为1.21±0.03、3.88±0.06、3.87±0.02及3.95±0.08;统计学分析表明annexin A5的蛋白的相对灰度值明显弱于阴性siRNA组（t=-70.34）、脂质体组（t=-150.62）及空白细胞组（t=-56.32）,P值均＜0.05;AnnexinV-FITC法结果当annexin A5基因沉默后,人喉癌细胞Hep-2凋亡率实验siRNA组、阴性siRNA组、脂质体组及空白细胞组分别为4.43％±0.12％、13.67％±0.22％、13.66％±0.12％及13.35％±0.13％,实验组细胞凋亡率较阴性siRNA组（t=-62.50）、脂质体组（t=-14.16）及空白细胞组（t=-11.47）明显降低,P值均＜0.05.结论 在人喉癌Hep-2细胞中,annexin A5可能促进凋亡,有可能成为喉癌诊断、治疗及预后的新的生物靶标.

携带p53基因的重组1型单纯疱疹病毒溶瘤特性的实验观察

目的利用同源重组技术获得插入p53基因的重组1型单纯疱疹病毒（HSV-1），并在体外培养细胞和荷瘤小鼠中研究其溶瘤特性。方法将含p53基因的真核表达框克隆人含HSV-1同源重组臂的pK05／BN，获得重组穿梭质粒pK05／p53，其电转含pHSV△IR—BAC的大肠杆菌后，筛选获得含有p53的重组DNApHSVAIR—BAC／053。pHSV△IR-BAC／053转染Vero细胞获得重组病毒，经Southem印迹和Western印迹鉴定正确后命名为MH1004。分别检测MH1004感染多种肿瘤细胞24h后的滴度，分析其在肿瘤细胞中的复制特性。建立小鼠黑色素瘤模型，于0、3、6d瘤内分别注射2×106 PFU的MH1004、未插入p53基因的重组HSV-1（MH1001）、HSV-1wt和PBS，观察肿瘤大小和小鼠生存时间并作统计学分析。结果Western印迹检测表明MHl01M所携带的p53基因可在感染细胞中表达；在同种肿瘤细胞中，MHIOIM和HSV-1wt的复制水平差异无统计学意义（P〉O．05）；MH1004在SK—N．SH和U251细胞中的复制水平显著高于其在其他肿瘤细胞中的复制水平；治疗15d后，HSV-1 wt、MH1001和MHl004组小鼠的肿瘤体积分别为（6180±751）、（5760±267）和（4850±532）mm3，显著小于PBS对照组（9860±91）mm3（均P〈0．01），MHl004组肿瘤体积小于MH1001组和HSV．1wt组，但差异均无统计学意义（均P〉0．05）。MH1004组小鼠生存率（5／6）显著高于PBS组（3／6）、HSV-1wt组（3／6）和MHl001组（3／6）。结论MH1004在神经肿瘤细胞中的复制水平较高，能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，并延长荷瘤小鼠的生存期。