损毁或高频刺激丘脑底核对黑质神经元的保护作用

目的:探讨损毁或高频刺激丘脑底核(STN)对帕金森病(PD)大鼠黑质致密部神经元的保护作用及其可能的发生机制。方法:应用6-羟基多巴胺(6-OHDA)制备偏侧PD大鼠模型,于丘脑底核(STN)区分别植入刺激电极给以高频电刺激,或注入鹅膏蕈氨酸(IA)进行损毁后,观察PD大鼠行为改变;运用尼氏(Nissl)染色、DNA原位末端标记技术(TUNEL)、免疫组化方法检测并分析黑质致密部(SNc)神经元存活及凋亡发生情况。结果:刺激组黑质致密部凋亡神经元的阳性率显著低于模型组与损毁组(P<0.05)。与正常大鼠相比,刺激组Bcl-2染色呈强阳性,Bcl-2/Bax比值较高,模型组、损毁组SNc区的Bcl-2表达有所下调,Bax表达增加,Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05),虽然损毁组SNc的凋亡阳性神经元少于模型组(P<0.05),但二者的Bcl-2、Bax的表达及Bcl-2/Bax比值无显著性差异(P>0.05)。结论:损毁或高频刺激STN对PD大鼠黑质SNc神经元存在保护作用,高频刺激的长期保护作用更为明显。

Mpl基因RNA干扰载体的构建及荧光显微镜筛选

目的:建立荧光显微镜快速筛选对血小板生成素受体(Mpl)基因RNA干扰片段的方法。方法:通过体外重组技术将Mpl与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合基因,克隆进pDs载体中产生pDs-Mpl-GFP载体,将人U6启动子及5个Mpl shRNA发夹结构(shMpl-A,shMpl-B,shMpl-C,shMpl-D,shMpl-E)分别克隆至pDs-Mpl-GFP真核载体中,构建出针对Mpl 5个不同位点的RNA干扰载体,然后将获得的上述干扰载体通过脂质体方法转染至293T细胞中,用荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数,判定构建的RNA干扰载体对靶基因RNA的干扰效果。结果:构建的5个干扰载体都能对转染的293T细胞中的Mpl-GFP融合基因进行有效的基因敲减作用,在pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A、pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-B与pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-E的干扰作用下,293T细胞中的荧光强度及发荧光细胞数目变得更少和更弱,干扰效果较好,而其它两个效果较差;在这三个较好的干扰载体中,pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A的干扰效果最好。结论:成功构建Mpl基因的真核RNA干扰载体,并筛选出有效的RNA干扰片段。