广西红水河流域长寿群体Smyca基因多态性分布及其对代谢危险因素的影响

目的:探究广西红水河流域长寿人群Smyca基因多态性的分布情况及其对衰老相关代谢指标的影响。方法:使用PCRSanger测序法对广西红水河流域长寿老人95例(长寿组,年龄≥90岁)及当地普通健康老人94例(对照组,年龄60~75岁)的Smyca基因进行多态性检测,使用Haploview分析单倍型的连锁不平衡(LD),并采用Pearson相关性分析方法来分析单倍体携带情况及长寿风险评估。结果:在Smyca基因中共检测出9个多态,其中长寿组rs2594713 AA基因型及等位基因A的频率显著低于对照组,CC基因型及等位基因C的频率则高于对照组(均P<0.05),其他基因型与等位基因频率在两组间的分布无明显差异(P>0.05)。3个单核苷酸多态性(SNPs);rs2594713、rs7255672和rs62122064位点之间存在较高的LD;长寿组ATA单倍型频率低于对照组(P<0.05);在长寿人群中,rs2594713、rs7255672和rs62122064位点的野生纯合型携带者甘油三酯(TG)及载脂蛋白B(ApoB)水平均低于突变型携带者(均P<0.05),其他代谢指标在野生纯合型及突变型之间无显著差异(P>0.05)。结论:Smyca某些多态位点的基因型与代谢相关指标存在明显关联,并且Smyca基因的3个SNPs位点之间存在着有遗传意义的单倍型和LD关系,并且单倍型ATA可能会降低长寿的概率。

人fgl2凝血酶原酶FRED结构域的原核表达、纯化及其凝血活性的鉴定

目的建立人fgl2凝血酶原酶纤维蛋白原相关结构域(fibrinogen-related domain,FRED)的原核表达系统,并鉴定表达蛋白的凝血活性。方法应用RT-PCR从外周血单个核细胞扩增fgl2凝血酶原酶FRED基因,克隆到原核表达载体pET22b(+),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达,重组蛋白经SDS-PAGE电泳和免疫印迹鉴定并用His-Tag柱纯化,以促凝活性(procoagulant activity,PCA)检测鉴定其凝血功能。结果扩增了人fgl2凝血酶原酶FRED基因,成功构建了重组pET-FRED原核表达质粒,表达的融合蛋白具有直接促凝血活性。结论建立了人fgl2凝血酶原酶FRED的高效原核表达系统,FRED可能为fgl2凝血酶原酶促凝血的活性区域。

人fgl2凝血酶原酶基因的真核表达及其凝血功能研究

目的将人fgl2凝血酶原酶基因进行真核表达,了解表达蛋白的分布特点,初步研究其凝血活性。方法将pcDNA3-fgl2重组质粒转化大肠埃希菌,利用脂质体转染至HL-60细胞;RT-PCR法检测其fgl2凝血酶原酶mRNA的表达,间接免疫荧光法标记fgl2凝血酶原酶蛋白,应用激光共聚焦显微镜观察其分布,流式细胞仪检测fgl2凝血酶原酶蛋白在细胞膜的表达;并通过检测转染细胞的促凝活性(PCA)分析其凝血功能。结果 pcDNA3-fgl2真核表达质粒在HL-60细胞中进行了瞬时表达,转染细胞可见明显的fgl2凝血酶原酶mRNA条带。激光共聚焦显微镜观察到转染细胞胞质中可见明显的绿色荧光,流式细胞仪在转染细胞胞膜上未检测到明显的蛋白表达。转染pcDNA3-fgl2重组质粒细胞的PCA明显增高且依赖于凝血酶原。结论成功地将fgl2凝血酶原酶基因在HL-60细胞中进行了瞬时表达;fgl2凝血酶原酶主要在胞质中表达,细胞膜上无分布并可能分泌到细胞外;凝血功能分析显示fgl2凝血酶原酶具有直接激活凝血酶原的功能。

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的:构建人血管内皮生长因子C(vascularendothelialgrowthfactorC,VEGF-C)基因的真核表达载体,以便进一步研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用。方法:根据人VEGF-C的cDNA序列,设计合成一对5'端分别含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的特异性引物,运用RT-PCR方法克隆人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的VEGF-CcDNA(1.26Kb);回收PCR产物(1.28Kb),并将其连接至克隆载体pMD18-T中;重组的pMD18-T在大肠杆菌DH5α内扩增后,经质粒提取、EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,筛选出阳性重组子,并进行基因测序鉴定;琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF-CcDNA全长的酶切片断(1.27Kb),然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3.1㈠连接,重组质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切予以鉴定。结果:RT-PCR产物含有VEGF-CcDNA,基因测序显示重组的pMD18-T中含有正确的人VEGF-CcDNA全长序列,重组的pcDNA3.1㈠中含有人VEGF-CcDNA全长序列。结论:成功构建了人类VEGF-C真核表达载体VEGF-C/pcDNA3.1㈠。

二代测序技术在临床医学上的相关应用

近年来,二代测序技术不断蓬勃发展,以其速度快、准确率高、成本低等优点逐步替代了第一代测序技术.其测序技术原理的不断创新和工程材料应用不断突破使得高通量的基因序列读取趋于个体化需求的应用.目前比较成熟的二代测序技术以454测序技术、Solexa测序技术以及SOLID测序技术为代表,应用二代测序技术的基本原理和性能特点,阐述其在临床医学上的相关应用.

血清脂阿拉伯甘露糖-IgG检测对痰菌阴性肺结核的诊断价值

目的评估血清脂阿拉伯甘露糖(LAM)-IgG检测对痰菌阴性肺结核的诊断价值。方法采用结核抗体快速检测试剂检测146例肺结核和127例非结核患者血清中LAM-IgG。结果肺结核组LAM-IgG阳性率为76.7%,其中痰菌阳性组为91.7%,痰菌阴性组为62.2%;非结核组LAM-IgG阳性率为10.2%。本法检测LAM-IgG的敏感性为76.7%,特异性为89.8%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论结核抗体快速检测试剂检测血清LAM-IgG操作简便快速,准确性高,可用于结核病的辅助诊断,特别是对痰菌阴性肺结核患者具有较高的鉴别诊断价值。

面向后基因组研究的基因陷阱技术

随着越来越多的生物基因组序列的公布,关于后基因组的工作也逐渐展开。基因陷阱,作为克隆基因和研究其功能的重要技术,越来越显示出其举足轻重的作用。其在定向筛选,大规模化等方面的发展,使到它的应用日渐广泛。本文将对近年来基因陷阱技术的发展和前景作一综述。

HHV-8 ORF73C基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术获得人疱疹病毒8型(HHV-8)ORF 73C基因,克隆至pGEM T-easy载体,进一步克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建含HHV-8 ORF 73C基因的重组表达质粒pGEXORF 73;重组表达质粒pGEXORF 73在大肠杆菌中得到有效表达。

南方汉族急性髓细胞白血病患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的研究

目的研究和分析南方汉族急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的基因频率和单倍型。方法采用序列特异性引物PCR(polymerase chain reaction with sequence-specific primers,PCR-SSP)技术对南方地区76例急性髓细胞白血病患者进行KIR基因的检测和分析,并与77例随机健康对照人群KIR基因频率进行比较。结果共检出16个KIR基因;在AML患者中检出15种基因型,正常人群中检出18种基因型。结论与正常人比较,AML患者各KIR基因频率无显著性差异。

构建SLE患者novel microRNA差异性表达谱及其靶基因的功能分析

目的构建系统性红斑狼疮(SLE)患者与健康对照者(NC)新小核糖核酸(novel microRNA)的差异性表达谱;对显著性差异表达的novel microRNA进行靶基因预测,对靶基因的GO(gene ontology)及KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)的功能进行分析,探讨SLE的发病机制。方法运用高通量测序技术(high-throughput sequencing)获得SLE与NC总的RNA,对总RNA进行长度分布、基因比对、RNA分类注释、RNA特有及公共序列统计后,运用Mireap软件预测novel microRNA。得到novel microRNA进行差异性表达分析,寻找两组之间具有显著性表达的novel microRNA。采用Targetscan软件对差异性表达的novel microRNA进行靶基因预测,并选取靶基因借用DAVID功能注释软件对其参与的生物学过程进行GO富集及KEGG通路分析。结果 61个novel microRNAs在SLE与NC组之间具有显著差异性表达,其中43个上调表达,18个下调表达。差异性表达novel microRNA的靶基因主要富集在细胞与小分子结合、细胞器官与细胞膜、细胞代谢中。靶基因KEGG通路主要体现在粘附复合体通路中。结论 SLE与NC的novel microRNA存在差异性表达。差异性表达novel microRNA的靶基因可能在SLE的发病机制与临床症状中起着重要作用,可能作为特异性靶点深入研究。

基因芯片在创伤中的应用

介绍基因芯片的特点、制作及工作原理 ,芯片提供大量数椐 ,以及这些数椐的统计、分析方法 ;简要综述了该技术在急性肺损伤、颅脑损伤、成纤维细胞损伤和血管内皮细胞损伤中的应用及其在医学研究中的应用前景。

分析基因表达图式的新方法

随着基因组研究的深入进行，基因的分子生物学除了要寻找在生物学上重要的个别基因并研究其结构与功能外，更重要的应是了解整个基因组的功能活动，即细胞全部基因的表达图式．要解决如此复杂的问题就必须在研究方法上有所创新，基因表达系列分析法、ｃＤＮＡ微阵列分析法。

西宁市汉族人群乙醛脱氢酶2基因多态性分布与饮酒行为的关系

目的了解西宁汉族人群中乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性分布与饮酒行为的关系。方法采用横断面研究。以聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对ALDH2基因型进行检测,将检测结果与具体饮酒行为结合行相关分析。结果等位基因ALDH2*2在汉族人群中饮酒者与非饮酒者的比例分别占8%和21%。结论西宁市汉族ALDH2基因与汉族人群饮酒量有关。

ABCB1基因多态性与肾移植患者围手术期服用他克莫司相关不良反应的相关性

目的:探讨腺苷三磷酸(ATP)结合盒转运体B1(ABCB1)基因多态性与肾移植患者围手术期服用他克莫司相关不良反应的相关性。方法:选取2014年11月-2018年3月于我院行肾移植术且术后服用他克莫司的患者170例,检测其ABCB1 C1236T(rs1128503)、ABCB1 G2677T/A(rs2032582)和ABCB1 C3435T(rs1045642)基因型。采用χ2检验比较不同基因型患者间他克莫司相关不良反应的发生率,相关不良反应包括消化道反应、肺部感染、肾功能异常、肝功能异常、血糖升高、血脂升高、白细胞降低。采用Logistic回归模型进行单位点危险度分析。应用PHASE软件分析患者上述基因的主要单倍型,并分析其主要单倍型与他克莫司相关不良反应的相关性。结果:170例患者中,ABCB1 C1236T(rs1128503)检测结果显示CC型21例(占12.3%)、CT型78例(占45.9%)、TT型71例(占41.8%);ABCB1 G2677T/A(rs2032582)检测结果显示GG型25例(占14.7%)、GA+GT型95例(占55.9%)、AA+AT+TT型50例(占29.4%);ABCB1 C3435T(rs1045642)检测结果显示CC型57例(占33.5%)、CT型82例(占48.2%)、TT型31例(占18.3%)。不同ABCB1基因型患者间消化道反应、肺部感染、肾功能异常、血糖升高、血脂升高、白细胞降低的发生率差异均无统计学意义(P>0.05),但ABCB1 C1236T(rs1128503)及ABCB1 C3435T(rs1045642)不同基因型患者间肝功能异常的发生率差异有统计学意义(P<0.05),ABCB1 G2677T/A(rs2032582)不同基因型患者间肝功能异常的发生率差异虽无统计学意义(P=0.069),但P<0.1。Logistic回归分析显示,ABCB1 C1236T(rs1128503)CC型[OR=4.959,95%CI(1.700,14.468),P=0.003]、ABCB1 G2677T/A(rs2032582)GG型[OR=3.500,95%CI(1.164,10.524),P=0.026]以及ABCB1 C3435T(rs1045642)CC型[OR=3.033,95%CI(1.012,9.095),P=0.048]均为他克莫司致相关肝功能异常的风险因子。ABCB1 CGC单倍型为主要单倍型,其携带与否与他克莫司相关肝功能异常的发生率差异存在统计学意义(P=0.002),且是他克莫司相关肝功能异常的风险因子[OR=3.173,95%CI(1.512,6.656),P=0.002]。结论:携带ABCB1 CGC单倍型的肾移植患者围手术期服用他克莫司出现肝功能异常的可能性较大。

细胞色素P450基因多态性与肿瘤易感性的关系

细胞色素P450(CYP450)是一类重要的体内代谢酶,它的基因多态性与肿瘤的易感性有着密切的关系,CYP450基因多态性与肿瘤易感性关系的研究有助于发现肿瘤的病因、预测肿瘤高危人群和判断肿瘤易感个体。

新疆地区哈萨克族人群KIR基因多态性及单体型研究

目的分析新疆地区哈萨克族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因多态性及基因型和单体型特点。方法采用序列特异性引物PCR方法(PCR-SSP),对随机选取新疆哈萨克族志愿者99(人)份标本做KIR基因检测,采用标准方法做基因型和单体型分析。结果 1)共检测出已知的16个KIR基因,其中KIR 3DL3、2DL4、3DP1、3DL2基因存在于所有个体,其基因频率为100%(99/99);2DL1、2DP1基因较为常见,基因频率为97.98%(97/99)、96.97%(96/99);2DS4、2DL3、3DL1基因频率为90.91%(90/99)、90.91%(90/99)、89.90%(89/99);3DS1基因频率最低为23.23%(23/99)。2)共检出23种基因型,其中以AF(1,2)最常见,频率为43.43%(43/99);发现有5种基因型共5例按Hsu的方法无法判定基因型别,其基因频率较低均为1.01%(1/99);比对分析发现:AB(3,13)和V(16,17)基因型各2例共4例在国内文献已研究的其他民族人群中未见报道,其频率为3.03%(3/99)和1.01%(1/99);U(17,21)型1例,在汉族人群中未见报道,仅见维吾尔族人群有2例报道。3)共检出14种单体型,最常见单体型占32.50%(61/188),其次是单体型1(n=59),占31.4%(59/188);而未检出的单体型有7、10、11、12、18、19、20、22、23;另有5例标本无法按标准方法分析出单体型,或提示存在新的单体型。结论新疆地区哈萨克族人群KIR基因多态性具有不同种族人群间的共同特性,又具有其自身独特的基因型及单体型分布特征。

人β-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

目的:克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法:以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-β和表皮生长因子基因,分别构建β-防御素-3(β-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到β-defensin-3 DNA序列的3'端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果,最后以Western blot对其进行特异性鉴定。结果:成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294 bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28 kDa左右的目的蛋白条带。Western blot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、β-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论:成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础。

H7N9病毒的M1基因序列分析及原核表达

目的 克隆H7N9禽流感病毒M1并在原核细胞中表达,为进一步研究其生物学特性、免疫学功能及血清学检测奠定基础。方法 用PCR方法从禽流感上海分离株A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）c DNA扩增M1基因,并克隆到载体p MD18-T中。经测序证实后,用EcoRⅠ/NdeⅠ双酶切,亚克隆到原核表达载体p ET28a,并转化E.coli BL21（DE3）菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定及western blot检验。结果 （1）经PCR、测序和酶切鉴定,成功克隆了禽流感H7N9 M1基因;（2）经IPTG诱导的重组质粒p ET28a-M1表达出约为28 k Da的融合蛋白,与预期结果相符;（3）对H7N9型禽流感M1基因序列分析表明,与2013年暴发的H7N9型禽流感病毒M1基因核苷酸序列同源性在95.4%-100%,与2006-2011年间暴发的H7N9型流感病毒M1基因序列同源性在69.0%-89.6%,2013年感染人的H7N9型流感病毒与此前暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支。结论 成功克隆了禽流感H7N9病毒的M1基因,并在E.coli中得以表达。