硝化应激在肺动脉高压中的研究进展

肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)是一种进行性发展的肺血管疾病,病理基础包括内皮功能障碍、平滑肌细胞异常增生、炎症浸润以及肺纤维化。PH的发生机制尚不完全清楚,但硝化应激已经证实在PH中发挥了重要作用。该文综述了活性氮(reactive nitrogen species,RNS)的种类及肺循环中RNS的来源,以及由此引发的硝化应激在PH发生发展中的作用,以期为靶向抗硝化治疗的临床应用提供参考依据。

眼镜蛇毒细胞毒素-1的分离纯化及其对HSC-LX2细胞PI3K/AKT 信号通路的影响

肝纤维化是多种刺激诱导的肝脏反复损伤的一种病理再生反应[1],其主要表征是肝脏中沉积着过量的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。ECM产生主要原因之一是由于肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)被大量激活分化,磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路是一条重要的细胞内信号通路,能通过影响HSC的增殖和凋亡来调节肝纤维化[2-4]。

蛇莓提取物通过GPX4诱导铁死亡抑制肾癌细胞OS-RC-2增殖

目的探讨蛇莓醇提物通过铁死亡抑制肾癌细胞OS-RC-2增殖的作用机制。方法蛇莓醇提物给药,CCK-8试验检测细胞增殖;活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒、GSH试剂盒、MDA试剂盒、细胞凋亡试剂盒分别检测细胞ROS、GSH、MDA含量及凋亡水平;网络药理学分析蛇莓成分-靶点;分子对接检测蛇莓成分与铁死亡核心靶点GPX4的结合能力;Western blot对铁死亡信号通路关键蛋白进行检测;利用铁死亡的抑制剂Fer-1和ROS抑制剂NAC进行回复试验,检测细胞增殖及铁死亡蛋白的变化;蛇莓醇提物中的Dulcitol(卫矛醇)给药,检测细胞增殖及GPX4蛋白的变化。结果蛇莓可在一定程度上呈时间-浓度依赖性抑制细胞增殖,显著增加ROS、MDA水平而降低GSH水平;流式细胞术显示蛇莓可显著促进细胞凋亡,但并没有呈浓度依赖方式;网络药理学和分子对接结果显示蛇莓中的卫矛醇与GPX4结合稳定(-6.5 kJ·mol^(-1));Western blot结果显示蛇莓明显降低GPX4、SLC7A11并升高HO-1及Transferrin蛋白水平;回复试验结果显示,Fer-1与蛇莓联合给药、NAC与蛇莓联合给药均可显著逆转蛇莓单独给药引起的细胞活力降低和铁死亡关键蛋白GPX4、SLC7A11、HO-1及Transferrin的蛋白水平变化。卫矛醇给药可抑制OS-RC-2细胞增殖并降低GPX4蛋白表达水平。结论综上所述,蛇莓醇提物可能通过降低GPX4的表达,促使肾癌细胞发生增殖抑制及ROS积累,进一步驱动细胞铁死亡,且卫矛醇可能是蛇莓中潜在的直接作用于GPX4的药效物质。

黄芪甲苷通过激活短链酰基辅酶A脱氢酶抑制Ang Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原表达

目的观察黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)诱导的大鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖和胶原表达的影响。方法原代提取并体外培养大鼠CFs,用短链酰基辅酶A脱氢酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase,SCAD)的沉默基因SiRNA1186预处理CFs 12 h后,加入Ang Ⅱ和AS-Ⅳ共同处理36 h。Western blot检测SCAD、α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的蛋白表达水平;荧光定量PCR检测SCAD、α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的mRNA表达水平;检测各组CFs中SCAD酶活性、ATP、羟脯氨酸和游离脂肪酸含量变化。结果Ang Ⅱ作用CFs 36 h后,与空白对照组比较,Ang Ⅱ组CFs增殖率,α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的蛋白和mRNA表达水平明显增加(P均<0.01),SCAD表达和酶活性均明显降低(P<0.01,P<0.05),ATP生成减少(P<0.01),羟脯氨酸和游离脂肪酸含量升高(P均<0.01);AS-Ⅳ给药处理后,CFs增殖和胶原表达明显减少(P均<0.01),SCAD表达和酶活性明显升高(P均<0.01),ATP生成增加(P<0.01),羟脯氨酸和游离脂肪酸含量减少(P均<0.01);然而,与Ang Ⅱ+NC组相比,Ang Ⅱ+SiRNA1186+AS-Ⅳ组各项指标均无差异,在SCAD SiRNA1186的干扰下,AS-Ⅳ对Ang Ⅱ诱导的CFs增殖和胶原表达的保护作用被取消。结论AS-Ⅳ可能通过激活SCAD,从而抑制Ang Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原表达。

乳腺癌中环氧化酶-2的表达及其与VEGF、MVD、MMP-9、TIMP-1的关系

目的研究乳腺癌组织中环氧化酶2(COX2)的表达及其与VEGF、MVD、MMP9和TIMP1的相互关系,探讨其在乳腺癌发生和浸润中的生物学意义。方法应用SP法检测65例浸润性乳腺癌组织中COX2、VEGF、MMP9、TIMP1及血管内皮标记物CD34的表达情况,并观察7例导管原位癌(DCIS)、45例癌旁乳腺组织中COX2的表达。结果65例浸润性乳腺癌、7例DCIS均表达COX2,其中浸润性乳腺癌中COX2高表达率为66.2%(43/65),而45例癌旁组织中21例有COX2弱表达,两者之间差异有显著性(P<0.01)。COX2与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、组织学分级、TNM分期、腋窝淋巴结转移均无相关性,但COX2在浸润性乳腺癌中的表达与VEGF、MMP9、TIIMP1及MVD均呈正相关(P<0.05)。结论COX2可能与乳腺癌组织中微血管形成和细胞外基质代谢有关。

4项检测指标诊断细菌性阴道病的价值比较

目的比较Amsel′s标准方法与安图阴道炎五联试剂盒(简称安图五联检测法)检测过氧化氢(H2O2)、白细胞酯酶(LE)、唾液酸苷酶(NA)、脯氨酸氨基肽酶(PIP)对细菌性阴道病的诊断价值。方法对中山市人民医院妇科就诊的1250例患者阴道分泌物标本进行常规Amsel′s标准方法检测,以安图五联检测法检测H2O2、LE、NA、PIP。结果 1250例受检者Amsel′s标准法检出细菌性阴道病220例,占17.6%;与Amsel′s标准法比较,阴道分泌物中H2O2、LE、NA、PIP的总符合率分别为61.6%、77.4%、95.3%、95.6%;敏感性分别为88.6%、99.5%、90.0%、91.4%;特异性分别为55.8%、72.6%、96.4%、96.5%;阳性预测值分别为30.0%、43.7%、84.3%、84.8%;阴性预测值分别为95.8%、99.9%、97.8%、98.1%。结论安图五联检测法与Amsel′s标准方法相比具有敏感性高、特异性较强、操作简便快速等优点,对传统的旧指标有互补和替代作用,可为临床诊治细菌性阴道病提供新的参考依据。

自由基在2型糖尿病大鼠膀胱逼尿肌损伤的作用与意义

目的探讨自由基在糖尿病膀胱功能障碍病理生理学机制中的作用和意义。方法分组观测不同时间段T2DM大鼠与正常对照组大鼠膀胱逼尿肌肌条收缩实验,并将剩余膀胱组织制备匀浆,测定其中超氧化物歧化酶(SOD)的活力与丙二醛(MDA)的含量。结果不同时间段T2DM组引起逼尿肌收缩的最小牵张力高于对照组。T2DM组在0～16周的收缩频率较对照组增高,在20周后减低。T2DM组最大收缩力呈现降低趋势。正常对照组膀胱匀浆中SOD第8周达最高峰后,呈现出下降趋势,至24周时有所增高。T2DM组4周时SOD出现增高,在8周和24周组大鼠膀胱中SOD较对照组显著下降。MDA在两组动物中都表现为进行性下降趋势。在第4周,T2DM组大鼠膀胱中MDA含量较对照组显著性降低。第8周出现MDA增高。T2DM组SOD/MDA的值低于正常对照组。在第4周时,T2DM组比正常对照组显著增高,第8周时,出现显著性降低。逼尿肌肌条收缩频率与逼尿肌最大收缩力之间呈负相关,(r=-0.226,P<0.05);MDA与逼尿肌最大收缩力之间呈正相关(r=0.234,P<0.01)。结论糖尿病可导致膀胱逼尿肌功能受损。在发病初期机体清除氧自由基的能力提高,膀胱功能处于代偿状态;随着病情进展,机体氧自由基损伤严重,膀胱逼尿肌功能失代偿。自由基损伤也是糖尿病膀胱逼尿肌损伤的重要机制之一。

肝细胞色素氧化酶Ⅰ在非酒精性脂肪肝大鼠形成中的作用

目的研究肝脏线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ(COXⅠ)在非酒精性脂肪肝大鼠的表达及其意义。方法Wistar大鼠40只,随机分为正常对照组和高脂饲料2、4、8、12周组(其中每组各8只);紫外分光光度法测定肝脏细胞色素氧化酶活性,Westernblot方法研究高脂饲料诱导的大鼠脂肪肝形成中肝细胞COXⅠ蛋白的表达变化,逆转录聚合酶链反应测定肝细胞COXⅠmRNA表达变化。结果脂肪肝2、4、8和12周细胞色素氧化速率分别为(0·88±0·32)、(0·76±0·37)、(0·48±0·26)、(0·39±0·21)/min,与正常对照组(0·98±0·37)/min较明显降低(P<0·01),肝细胞COXⅠ基因及蛋白表达随着脂肪肝程度的加重亦明显增强。结论非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞色素C氧化酶活性下降以及线粒体编码呼吸链相关的细胞色素C氧化酶COXⅠ基因和蛋白质降低,与脂肪肝引起的肝脏损害密切相关。

非小细胞肺癌中HIF-1α、GLUT1与COX-2表达的关系

目的探讨非小细胞肺癌(non-sm all cell lung cancer,NSCLC))急慢性乏氧状况、乏氧与COX-2过度表达及与临床病理特征的关系。方法应用兔抗人H IF-1α、GLUT1抗体和鼠抗人COX-2抗体对手术切除的46例肺癌组织进行免疫组化染色,并与临床病理资料进行相关性分析。结果肺癌患者46例,其中ⅠA期12例,ⅠB期20例,Ⅱ期8例,ⅢA期6例。H IF-1α、GLUT1和COX-2的阳性表达率分别为58.70%(27/46)、39.11%(18/46)和67.39%(31/46)。COX-2表达与H IF-1α、GLUT1的表达相关(P<0.01)。GLUT1表达与肺癌患者淋巴结转移(P<0.05)、组织学类型(P<0.01)有关,而H IF-1α、COX-2表达与年龄、性别、分期、肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型和肿瘤分化程度均无相关性。结论NSCLC患者同时存在着急、慢性乏氧,而肿瘤转移主要与慢性乏氧有关。另外,乏氧可能参与了COX-2增强表达的机制。

动态对比增强磁共振成像影像组学评估胶质瘤异柠檬酸脱氢酶1突变与微血管生成

目的:探讨动态对比增强磁共振成像(DCE-MRI)影像组学在评估胶质瘤异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)突变与微血管生成中的应用价值。方法:回顾性分析105例经病理证实的胶质瘤患者,按7:3分为训练组和验证组,采用3DSlicer软件半自动勾画感兴趣区,依次从T 1WI,T 2FLAIR,ADC,容积转运常数(K trans)及血管外细胞外容积比(V e)图像中提取影像组学特征。利用最小绝对收缩和选择算子算法进行特征选择并计算影像组学评分(Radscore),基于筛选出的影像组学特征构建预测胶质瘤IDH1突变的支持向量机模型。对纳入的临床放射学特征进行逻辑回归分析,结合Radscore建立综合列线图。应用免疫组化检测胶质瘤IDH1基因分型、血管内皮生长因子(VEGF)表达、CD105阳性标记的微血管密度(CD105-MVD)。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价模型的诊断效能。采用Spearman相关性检验分析Radscore与VEGF表达、CD105-MVD的相关性。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:K trans与V e联合模型评估胶质瘤IDH1突变训练组AUC=0.889,验证组0.890;综合列线图训练组AUC=0.938,验证组0.914。各模型的Radscore与VEGF表达、CD105-MVD均呈负相关,其中联合模型的相关性最高(r=-0.570,P<0.001;r=-0.665,P<0.001)。结论:DCE-MRI影像组学可有效评估胶质瘤IDH1突变,且在分析胶质瘤IDH1突变与血管生成相关性方面具有重要临床价值。

地塞米松诱导PC12细胞氧化应激损伤及对NOX2表达的影响

目的观察地塞米松(DEX)对大鼠嗜铬瘤细胞(PC12)细胞氧化应激损伤及对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)表达的影响。方法体外培养的PC12细胞随机分为正常对照组、H2O2(100μmol/L)组、DEX(1、5、10μmol/L)组。四甲基偶氮唑盐(MTT)法测细胞存活率,双氢溴化乙啶(DHE)荧光染色法测定细胞内活性氧(ROS)水平。RT-PCR法检测NOX2、小G蛋白(Rac1)mRNA表达。Western blot法检测NOX2、p47phox的表达。结果与正常对照组比较,DEX作用于PC12细胞24 h后,DEX(5、10μmol/L)组细胞活力下降、ROS水平显著增高。进一步研究显示DEX(5、10μmol/L)组可以上调NOX2和Rac1 mRNA的表达,可以增加NOX2、p47phox的表达。结论 DEX可以增加PC12细胞ROS的生成,诱导PC12细胞氧化应激损伤,其机制可能与增加NOX2表达有关。

人参皂苷Rg1通过抑制NOX4/MAPK通路减轻棕榈酸钠诱导HMCs细胞的纤维化

目的探讨人参皂苷Rg1对棕榈酸钠(sodium palmitate,PA)诱导的人肾小球系膜细胞(human mesangial cells,HMCs)纤维化的抑制作用及机制。方法(1)用不同浓度的PA将HMCs处理24 h,通过油红O染色观察脂质变化,H2DCFDA法检测ROS生成情况;(2)将HMCs细胞分为对照组、PA(160μmol·L^(-1))组、HG(25 mmol·L^(-1))组、PA+HG组,用活细胞成像观察细胞24 h内形态变化;(3)将HMCs细胞分为对照组、PA(160μmol·L^(-1))组、PA+Rg1(5μmol·L^(-1))组、PA+Rg1(10μmol·L^(-1))组、PA+Apocynin(50μmol·L^(-1))组,免疫荧光法检测Col4的表达,Real-time PCR检测Col4、TGF-β和FN的mRNA表达;Western blot测定TGF-β、FN以及NOX4、MAPK通路相关蛋白表达。结果PA各浓度处理HMCs可剂量依赖性增加细胞内脂质沉积和ROS生成;PA组和PA+HG组均能导致HMCs细胞形态异常变化;Apocynin和Rg1(5、10μmol·L^(-1))可抑制PA引起的HMCs内脂质积累、ROS的增多,以及Col4、TGF-β和FN mRNA的过表达,并明显下调PA诱导的HMCs中TGF-β、FN、NOX4和MAPK相关蛋白的增多。结论人参皂苷Rg1能明显抑制PA诱导的HMCs细胞的纤维化,其机制可能与减少脂质沉积、抑制NOX4/MAPK通路等有关。

NS-398诱导肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制

目的探讨NS-398诱导肝癌细胞HepG2凋亡的分子机制。方法采用MTT法测定COX-2选择性抑制剂NS-398对HepG2细胞的增殖抑制率;流式细胞仪检测凋亡;原位细胞凋亡检测法观察细胞凋亡形态学变化;免疫细胞化学分析COX-2、cIAP-1、XIAP、Survivin蛋白变化。结果 NS-398对HepG2细胞株有增殖抑制作用,流式细胞仪检测用药组凋亡率明显高于对照组。TUNEL染色可见典型的凋亡形态学特征。免疫细胞化学分析表明使用NS-398后,COX-2、cIAP-1、XIAP、Survivin蛋白表达降低。结论 COX-2选择性抑制剂NS-398对人肝癌细胞株HepG2有诱导凋亡作用,其机制可能通过抑制COX-2,下调cIAP-1、XIAP、Survivin的表达而诱导凋亡。

慢性束缚应激对雄性小鼠下丘脑腹内侧核神经元NADPH氧化酶表达及ROS生成的影响

目的观察慢性束缚应激对小鼠下丘脑腹内侧核(VMH)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADPH)氧化酶表达及活性氧(ROS)氧化应激损伤的影响。方法实验分为对照组和慢性束缚应激组,每周记录小鼠24 h摄食量和体重变化,用二氢乙啡啶(DHE)染色法检测VMH ROS的生成,HE染色观察VMH形态学变化,免疫组化检测VMH NOX2、p47phox和RAC1的表达,Western blot法检测下丘脑PKCα、NOX2、p47phox和RAC1的表达。结果与对照组比较,慢性束缚应激能明显降低小鼠24 h摄食量和体重;DHE染色结果显示,慢性束缚应激能明显增加小鼠VMH神经元ROS的生成;HE染色结果显示,慢性束缚应激能明显导致VMH神经元损伤;免疫组化和蛋白印迹结果显示,与对照组比较,慢性束缚应激小鼠VMH神经元PKCα、NOX2、p47phox和RAC1的表达明显增加。结论慢性束缚应激可导致小鼠VMH神经元损伤,其机制可能与增加VMH神经元NADPH氧化酶介导的ROS生成增多有关。

二氢嘧啶脱氢酶活性在食管癌5-FU化疗中的应用价值

目的测定食管癌患者化疗前血二氢嘧啶脱氢酶(DPD)活性,并评价其与临床特征、化疗疗效及毒性之间的相关性。方法符合入选标准的食管癌患者68例,采用高效液相色谱法(HPLC)法测定血内源性二氢尿嘧啶(H2U)/尿嘧啶(U)值代表血DPD活性,化疗方案为FLP(5-FU/CF/PDD)方案。评价患者血DPD活性和临床特征、化疗疗效及毒性之间的相关性。结果68例食管癌患者均接受FLP方案化疗。化疗前查血DPD活性为3.27±1.35,最低1.72,最高6.79,呈正态分布,个体差异较大。Spearman相关分析统计显示血DPD活性与5-FU致毒性反应及化疗疗效呈负相关。血DPD活性与一般临床特征无相关性。结论检测血DPD活性可以预测5-FU化疗毒性和化疗疗效,为实现食管癌的个体化治疗提供了理论依据。

血清丙氨酸氨基转移酶两种不同检测方法的比较分析

目的对干化学法和全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)进行方法学的评价。方法同一样本分别在实验室用OLYMPUS全自动生化及移动采血点用干式生化分析仪进行ALT测量,对两种方法的测定结果进行统计学分析。结果干化学试纸法与全自动生化分析仪法检测ALT结果差异无统计学意义(P>0.05),高度的一致,且批内变异系数小于5%,精密度高。结论干式生化分析仪具有检测结果准确、携带方便、操作简单等特点,适合用于街头献血者血液筛查。

NADPH氧化酶gp91^(phox)与核因子-κB在子痫前期胎盘中的表达

目的观察子痫前期患者胎盘NADPH氧化酶与NF-κB的变化,探讨二者在子痫前期的发生发展中的作用及相关性。方法采用免疫组织化学和RT-PCR方法检测25例子痫前期患者(子痫前期组,其中轻度组15例,重度组10例)和25例正常足月孕妇(正常组)胎盘组织中的NADPH氧化酶gp91phox亚基及NF-κB p65亚基的表达水平。结果免疫组织化学结果显示:(1)子痫前期组胎盘NADPH氧化酶gp91phox亚基及NF-κB p65亚基胞质表达均较正常组明显增强,2组比较差别有统计学意义(P<0.05);且二者在重度组表达均高于轻度组(P<0.05)。(2)子痫前期轻度组及重度组的NF-κB亚基活化与其NADPH氧化酶表达强度呈正相关。RT-PCR结果显示:(1)NADPH氧化酶gp91phox亚基mRNA与免疫组织化学结果相平行;(2)子痫前期组胎盘NF-κB p65亚基mRNA表达较正常组无明显增多,2组比较差别无统计学意义(P>0.05)。结论 NADPH氧化酶与NF-κB参与了子痫前期发生发展的病理过程;子痫前期患者胎盘NADPH氧化酶表达增多、活性增强,可能通过进一步诱导NF-κB活化引起机体相关的病理生理改变。

双向电泳分析CCR5对二氢叶酸还原酶表达的抑制作用

目的:采用双向电泳为基础的蛋白质组学的研究手段,发现趋化因子受体5被配体激活后的功能相关蛋白质。方法:构建稳定表达CCR5的HEK-293细胞株。用RANTES刺激12 h后,用双向电泳方法进行分析。在以PDQuest图像分析软件进行分析后,对表达有差异的蛋白质进行MOLDI-TOF MS/MS质谱鉴定,并对鉴定的蛋白作RT-PCR初步分析。结果:流式细胞仪检测结果表明HEK-293细胞稳定表达CCR5,在受RANTES刺激后作双向电泳分析并经质谱鉴定后,发现二氢叶酸还原酶表达降低,与RT-PCR检测结果相一致。结论:经蛋白质学组方法分析,发现CCR5被其配体RANTES 激活后抑制了二氢叶酸还原酶的表达。

不同热变温度对新生儿脐带血中超氧化物歧化酶提取的影响

超氧化物歧化酶（SOD）是一种针对O-2的抗氧化防御的主要酶,它能催化超氧阴离子转化为H2O2和O2,能消除新陈代谢生命活动过程中产生的有害物质。一个高效的SOD制备方法在应用研究中非常必要,目前,学者们已经研究出了多种检测提取SOD的方法,热变法提取SOD操作简单。本研究主要探讨的是热变法提取新生儿脐带血中SOD的最适温度。

急性脑梗死患者尿8-异前列腺素F_(2α)排出量的变化

目的探讨急性脑梗死患者尿8-异前列腺素F2α排出量的变化,明确其体内氧化自由基产生情况。方法选取20例脑梗死患者作为试验组,根据发病时间分别测定发病24h内和发病第14d时尿8-异前列腺素F2α的浓度。并根据标准选取19例体检者作为对照组。结果(1)脑梗死患者发病24h内和发病第14d时尿8-异前列腺素F2α的浓度与正常对照组间差别有显著性意义(P<0.01);(2)脑梗死患者发病第14d时与发病24h内尿8-异前列腺素F2α浓度间差别有显著性意义(P<0.01)。结论急性脑梗死患者体内脂质过氧化有显著增加,常规治疗第14d时体内氧化应激反应仍在加重。